第十届原创大赛有奖征文——脂溶性异构体样品制备分离

yongzhbenq

2017/08/30

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一、前言
随着键合技术的发展，越来越多的填料适合于结构异构体的分离。
针对极性化合物的异构体分离，我们可以选择含卤素的键合相，比如常见的PFP或者F-C8
针对非极性化合物的异构体分离，我们可以选择多层键合的键合相，比如常见的PAH或者C30。
本文以我们实验室制备分离纯化的一个样品为例，简单探讨一下制备分离纯化的过程，欢迎小伙伴们一起探讨学习，共同提高。

二、填料筛选
客户样品是脂溶性油状物，并且存在着难以分离的结构异构体，我们选择三款键合相不同的色谱柱Welch Ultimate XB-C18（单层键合），Welch UltimatePAH（多层键合），Welch Ultimate XB-C30（多层键合）对目标物质进行分离。使用客户的分析条件（表1），进样20uL。
表1 填料筛选条件

色谱柱	Welch Ultimate^RXB-C18，10um，4.6250mm； Welch Ultimate^RPAH，10um，4.6250mm； Welch Ultimate^RXB-C30，10um，4.6*250mm
流动相	甲醇：乙腈=70:30
流速	1mL/min
检测波长	254nm
样品	称量样品1.0mg，使用流动相1mL溶解样品，过滤。
上样体积	20uL

由于考虑到后期规模化制备，因此填料筛选时使用10um粒径的填料进行。谱图如下：
a、XB-C18谱图
b、PAH谱图
c、XB-C30谱图

从上面的谱图明显看出，Welch Ultimate XB-C18，Welch Ultimate PAH对分离的影响不大，但是Welch Ultimate XB-C30较其他两种填料多分出一个峰，表明Welch Ultimate XB-C30更适合于这个混合物的分离。因此，固定制备条件（表2）。

表2 制备条件

色谱柱	Welch Ultimate^RXB-C30，10um，4.6*250mm
流动相	甲醇：乙腈=70:30
流速	1mL/min
检测波长	254nm
上样体积	20uL

同时，在后续的纯度检测中，使用我们也同样使用Welch Ultimate XB-C30，5um，4.6*250mm取代Welch Ultimate XB-C18，5um，4.6*250mm对样品的纯度检测分析。

表3 分析条件

色谱柱	Welch Ultimate^RXB-C30，5um，4.6*250mm
流动相	甲醇：乙腈=70:30
流速	1mL/min
检测波长	254nm
上样体积	20uL

四、使用制备柱对样品进行制备分离
使用丙酮溶解样品，浓度为30mg/mL，使用Welch Ultimate XB-C30，10um，30*250mm ，根据上样量与色谱柱的内径平方成正比计算得到30mm内径的制备柱上样量大约在4ml，流速40ml/min。经过微调，将流速降低到30ml/min。谱图如下：

分段收集：49-59min，59-69min，69-96min，96-100min，100-104min。分别标记为b1、b2、b3、b4、b5。

对收集后的样品进行分析测试

分段收集后，使用分析条件对收集的样品进行纯度分析。

b1号样品目标峰纯度：97.6%

b2号样品目标峰纯度：98.5%

b3号样品目标峰纯度：98%

b4号样品目标峰纯度：94.2%

b5号样品目标峰纯度：87%

五、结论

使用丙酮溶解样品，浓度为30mg/mL，一次上样4mL，具体条件如下：

色谱柱	Welch Ultimate^RXB-C30，10um，30*250mm
流动相	甲醇：乙腈=70:30
流速	30mL/min
检测波长	254nm
上样量	120mg

纯度及回收率如下表，符合客户要求：

样品纯度	回收率
大于等于98%	89.88%

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我是风儿

第1楼2017/08/30

应助达人

请问第四部分分段时间收集b1、b2、b3、b4、b5的原理是什么？为什么可以根据这样的时间段进行收集不同的物质？

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zyl3367898

第2楼2017/09/04

应助达人

前面出平头峰，后面出大趴峰，这峰出的不对。

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yongzhbenq

第3楼2017/09/07

这个文章，中间省却了小柱逐级放大的过程，在放大过程中，我们一开始是每隔相同时间点进行收集，并检测纯度。
因此在后期制备的时候，针对峰从顶点下落的时候这一段，也就是b4，纯度虽然不符合要求，但是需要收集进行二次纯化。
我是风儿(nphfm2009) 发表:请问第四部分分段时间收集b1、b2、b3、b4、b5的原理是什么？为什么可以根据这样的时间段进行收集不同的物质？