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第十届原创大赛有奖征文--换个角度结果就不同---记一个杂质分离方法开发过程

g15160563

2017/09/25

毕业到现在也有些年头了，很荣幸刚毕业就接触液相，并一直从事液相相关的工作，各种类型，各种难题，应该说差不多都算见过。现在回想一下，一路走来都是一点点积累，一点点成长。以下给大家分享的是一个我自己认为比较经典的案例，有时候换个角度，换种思路，结果就不一样了。

首先来看看需要分离的三个物质的结构式：

1.分析目的要求：
开发一种合适的分析方法，使上述3种化合物在浓度1.0mg/ml的情况下分离度大于1.50；
开始方法开发之前，第一件该做的事是什么呢？
当然是去了解这几个物质的性质，尽可能的得到有关这些物质的信息，这样可以为后面工作节省最多的时间。而对这三个物质得到的信息大致如下：三种物质极性比较强，水溶性比较好，在常规C18色谱柱保留太弱，基本上与溶剂峰重叠。结构式上主要是官能团的差异，分别为-NH2，-Br，-COOH，差异性很大。综合考虑，有俩种方案：一是加离子对试剂，用反相C18色谱柱增强保留，进行分离；二是使用离子交换色谱柱进行分离。首先由于个人的习惯，离子交换色谱被我直接排除（离子色谱平衡比较慢，而且离子交换色谱柱非常容易出现重现性问题）。所以本实验采用C18添加离子对试剂的方法。
考虑的实验过程中需要使用离子对试剂，且流动相pH需要大范围调整（可能用到碱性流动相），所以色谱柱选择月旭XtimateC18（4.6×250mm，5μm）色谱柱，流速：1.0ml/min，柱温30℃，检测波长220nm。
2.流动相优化及测试结果图谱
2.1 初步尝试流动相：0.05mol/L庚烷磺酸钠+0.05mol/L磷酸二氢钾，PH=4.60
结果：化合物3保留时间2.6min，化合物1不出峰。估计是化合物1保留太强未洗脱下来。接下来，调整pH并增加有机相的比例，来加大洗脱能力；
2.2 流动相：缓冲液（1.00g辛烷磺酸钠，10mM磷酸二氢钾至500ml水中，用磷酸调PH=2.30）：甲醇=60：40
混合对照图谱如下：

实验中将庚烷磺酸钠改为辛烷磺酸钠，增加有机相（甲醇）比例，结果三个物质分离良好，但是化合物1（19.9分钟）峰型太差，下一步优化化合物1的峰型。
2.3 流动相：缓冲液（1.00g辛烷磺酸钠，10mM磷酸二氢钾至500ml水中，用磷酸调PH=2.30）：乙腈=80：20
化合物1图谱：

基于上一次实验，将有机相甲醇变为乙腈，通过改变选择性看是否峰型会有改善。结果发现并没有任何改善，而且发现这个方法中有机相只提供洗脱能力，不提供选择性改变作用。
2.4 流动相：缓冲液（缓冲液：1.00g十二烷基磺酸钠，50mM氯化铵至500ml水，用磷酸调PH=1.80）：甲醇=60：40
混合对照图谱：

当时换成这个流动相的主要思路是，加十二烷基磺酸钠使保留更强，加氯化铵提高离子浓度，调PH至1.80强酸性使化合物1中-NH2官能团作用更弱，达到优化峰型的目的，但是效果很差。回头总结发现我们所有的目光都聚焦在三种物质的不同官能团上，导致越走越偏离分离的轨迹，这里，三个物质共同含有的官能团可能也是影响分离的主要因素，换了个角度后，豁然开朗了。推翻了之前的方案，将离子对试剂换为四丁基氢氧化铵，从头开始。
2.5 流动相：缓冲液（4ml 10%四丁基氢氧化铵水溶液，1.36g磷酸二氢钾至500ml水中，用三乙胺调PH=9.30）：乙腈=80：20

混合对照图谱：

流动相中添加三乙胺和并将PH调成9.3目的是抑制化合物1的拖尾，但是结果发现三种物质没有分开。继续优化条件将PH值降低。
2.6 流动相：缓冲液（4ml 10%四丁基氢氧化铵水溶液，1.36g磷酸二氢钾至500ml水中，用三乙胺调PH=7.00）：乙腈=80：20

混合对照图谱：

看到这结果是不是项目就OK了。但是既然是方法开发，方法重现性实验实验是必不可少的，需要用一根新色谱柱重现该色谱条件。
结果问题就来了。化合物1图谱：

化合物1峰型一直分叉，最终发现应该是色谱柱使用多种离子对试剂，造成色谱柱改性，新色谱柱不能重现结果。好吧，再开始。
然后又是继续摸索。不得不说有时候运气也是成功的一部分，在一次流动相配置过程中，看到四丁基氢氧化铵试剂旁边还有一瓶四丁基溴化铵，突然我就冒出想法，用四丁基溴化铵试试，不知道结果会怎么样，说做就做。
2.7 流动相：缓冲液（1.00g四丁基溴化铵，1.36g磷酸二氢钾，1.0ml三乙胺至500ml高纯水。用磷酸调节PH=7.10）：乙腈=80：20
混合对照图谱：

结果：分离度，峰型都满足要求，完美。当然还是需要重现方法的。
三根新色谱柱重现结果：

最终色谱条件：
色谱柱：月旭Xtimate C18（4.6*250mm，5μm）
流动相：缓冲液（1.00g四丁基溴化铵，1.36g磷酸二氢钾，1.0ml三乙胺至500ml高纯水。用磷酸调节PH=7.10）：乙腈=80：20
检测波长：220nm；柱温：30℃；流速：1ml/min；进样体积：10μl
搞定交差！！！！
3、总结

在液相应用方法开发过程中，首先需结合需要分离的目的，确定思路，一个方法最初的思路，是决定这个方法开发的效果，效率的最根本因素；其次是细节，任何细节都有可能导致你实验的成功与否；最后是运气，牛顿发现万有引力还有运气成分呢，说不定你是下一个。
同时，在一个方法确定好之后，一定需要使用一根新的色谱柱来验证，因为在方法开发过程中，我们会使用到各种流动相条件，会对色谱柱一个改性，特别是使用离子对试剂的方法，否则后续的重现性问题会是一个非常头痛的事情。

精
该帖子已被管理者-月旭科技--小S设置为精华，下面是奖励记录：加20积分,加5声望

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初心

第1楼2017/09/25

应助达人

方法开发真不容易，需要不断尝试

0

月旭科技--小S

第2楼2017/09/25

感谢楼主的宝贵经验分享！方法开发真是需要智商非常高，并且热爱钻研的人，又不怕挫败，佩服！感谢像楼主这样的人，为国家的色谱事业发展，所做出的贡献！

0

月旭科技-雪妖

第3楼2017/09/25

这种差异物质相对来说差异比较小，LZ费了很多心思。

0

氢锂钠钾铷铯钫

第4楼2017/09/25

值得学习了，新颖！
通过作者文章，感觉作者是读了几本书的。

0

hanyxin

第5楼2017/09/25

从作者提供的图谱来看，前两个峰的保留还是稍微弱了一点，第3个峰的保留稍强。
可以考虑采用梯度洗脱

0

zyl3367898

第6楼2017/10/02

应助达人

为何换成四丁胺氢氧化铵？理由是什么？

0

wsy18

第7楼2017/10/03

不错的原创。

0

月旭科技-雪妖

第8楼2017/10/17

很好的思路，楼主的经验相当丰富呢

0

氢锂钠钾铷铯钫

第9楼2017/10/20

不错的好文章！

0

wsy18

第10楼2017/10/20

思路很开阔。
月旭科技-雪妖(czj_1027) 发表:很好的思路，楼主的经验相当丰富呢

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