食品中胡萝卜素的测定方法验证报告

高秋荣

2018/07/24
国联质检团队

私聊

液相色谱（LC）

食品中胡萝卜素的测定方法验证报告

GB 5009.83-2016

张霞

一、方法概述

1.范围
本标准规定了食品中胡萝卜素的测定方法。
本标准色谱条件一适用于食品中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及总胡萝卜素的测定，色谱条件二适用于食品中β-胡萝卜素的测定。
2.原理
试样经皂化使胡萝卜素释放为游离态，用石油醚萃取二氯甲烷定容，采用反相色谱法分离，外标法定量。
二、仪器与试剂
1. 仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
1.2 匀浆机。
1.3高速粉碎机。
1.4恒温振荡水浴箱：控温精度±1℃。
1.5旋转蒸发器。
1.6氮吹仪。
1.7紫外-可见光分光光度计。
以上仪器符合国标要求。
2. 试剂及其配制
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
2.2木瓜蛋白酶：酶活力≥5U/mg。
2.3 氢氧化钾（KOH）。
2.4无水硫酸钠（Na₂SO₄）。
2.5 抗坏血酸（C₆H₈O₆）。
2.6石油醚：沸程30℃~60℃。
2.7甲醇（CH₄O)：色谱纯。
2.8三氯甲烷（CHCl₃）：色谱纯。
2.9甲基叔丁基醚[CH₃OC（CH₃）₃]：色谱纯。
2.10二氯甲烷（CH₂Cl₂）：色谱纯。
2.11无水乙醇（C₂H₆O）：优级纯。
2.12正己烷（C₆H₁₄）：色谱纯。
2.13 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（C₁₅H₂₄O，BHT）。
2.14氢氧化钾溶液：称固体氢氧化钾500g，加入500mL水溶解。临用前配制。
2.15β-胡萝卜素标准品来源：上海安谱货号：CDAA-281456
三、试样的制备
谷物、豆类、坚果等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm~0.5mm）；蔬菜、水果、蛋、藻类等试样用均质器混匀；固体粉末状试样和液体试样用前振摇或搅拌混匀。4℃冰箱可保存1周。
四、分析步骤
1、标准曲线绘制
1.1 标准储备液（500.0μg/mL）:称取0.0500g（准确至0.0001g）β-胡萝卜素标准品于100mL容量瓶中，加入0.25gBHT，用二氯甲烷溶解，并定容至刻度。
1.2标准工作液的配制：
分别吸取适量β-胡萝卜素标准溶液，用二氯甲烷定容至100mL容量瓶中，配制成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL系列工作液。
2、样品的处理
2.1普通食品试样
2.1.1预处理：蔬菜、水果、菌藻类、谷物、豆类、蛋类等普通食品试样准确称取混合均匀的试样1g~5g（精确至0.001g），油类准确称取0.2g~2g（精确至0.001g），转至250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸、75mL无水乙醇，于60℃±1℃水浴振荡30min。
如果试样中蛋白质、淀粉含量较高（＞10%），先加入1g抗坏血酸、15mL45℃~50℃温水、0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶，盖上瓶塞混匀后，置55℃±1℃恒温水浴箱内振荡或超声处理30min后，再加入75mL无水乙醇，于60℃±1℃水浴振荡30min。
2.1.2皂化：加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，皂化30min。取出，静置，冷却到室温。
2.2添加β-胡萝卜素的食品试样
2.2.1预处理：固体试样，准确称取1g~5g（精确至0.001g），置于250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸，加50mL45℃~50℃温水混匀。加入0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶（无淀粉试样可以不加α-淀粉酶），盖上瓶塞，置55℃±1℃恒温水浴箱内振荡或超声处理30min。液体试样，准确称取5g~10g（精确至0.001g），置于250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸。
2.2.2皂化：取预处理后样品，加入75mL无水乙醇，摇匀，再加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，皂化30min。取出，静置，冷却到室温。
2.3试样萃取：将2.1.2或2.2.2中皂化液转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡10min后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法惊醒第二次提取。合并有机相，用水洗至近中性。弃水相，有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入500mL蒸发瓶中，于旋转蒸发器上40℃±2℃减压浓缩，近干。用氮气吹干，用移液管准确加入5.0mL二氯甲烷，盖上瓶塞，充分溶解提取物。经0.45μm膜过滤后，弃去初始约1mL滤液后收集至进样瓶中，备用。
3.仪器测定条件
3.1色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm或等效柱。
3.2流速：2.0mL/min。
3.3柱温：35℃±1℃。
3.4检测波长：450nm。
3.5进样量：20μL。
3.6流动相：三氯甲烷：乙腈：甲醇=3:12:85，含抗坏血酸0.4g/L，经0.45μm膜过滤后备用。
五、结果处理
试样β-胡萝卜素含量按下式进行计算：

X(μg/100g)=	C×V×100
	m

式中:X-试样中β-胡萝卜素含量,单位为微克每百克(μg/100g);
C-由标准曲线得到的待测液中β-胡萝卜素的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
m-试样质量,单位为克(g);
V-试样液定容体积,单位为毫升(mL)。
100—换算系数。
计算结果保留三位有效数字。
六、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
同时做空白实验。
β-胡萝卜素Y=8481.49*X+34.6455 R^2=0.9999677

以上结果表明β-胡萝卜素在0.5μg/mL～10μg/mL范围内，R^{^2}=0.9999677，β-胡萝卜素浓度和峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将1.00μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出β-胡萝卜素的方法检出限为0.5μg/100g，此检出限结果等于国标GB 5009.83-2016的方法检出限0.5μg/100g，故此方法满足条件。
七、方法精密度（重复性）
对LBF180700283样品分别进行6次加标重复性的测定，测定结果如下：

测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	5.0074	5.0051	5.0368	5.0109	5.0421	5.0247
浓度（μg/mL）	1.576	1.575	1.578	1.575	1.577	1.575
含量（μg/100g）	157	157	157	157	156	157
平均值（μg/100g）	157
RSD%	0.26

本方法的精密度为0.26%，符合GB 5009.83-2016中给出试样测试结果的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
八、准确度验证（加标回收）
对LBF180700283样品加标，取50.0μg/mL的标液0.075mL、0.12mL、0.22mL同样品同步处理后，结果见下表：

测定编号		β-胡萝卜素
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	β-胡萝卜素含量（μg/100g）	平均值（μg/100g）	加标量（μg/100g）	回收率%
1#	5.0429	5.0	0.835	82.79	82.9	/	/
2#	5.0560	5.0	0.839	82.97	82.9	/	/
加标1#	5.0361	5.0	1.554	154	154	74.5	95.4
加标2#	5.0285	5.0	2.018	201	201	119	99.2
加标3#	5.0284	5.0	2.999	298	298	219	98.2

由上表可以看出β-胡萝卜素测定的加标回收范围在 80%-110% ，RSD值为2.02%符合规定要求。
九、总结
从检出限、线性范围、重复性、回收率测试结果可知，均符合方法要求，本实验方法符合GB 5009.83-2016的要求。