xxxx胶囊微生物限度方法适用性试验
根据中国药典2015年版要求，为保证该分析方法有效性，确保检验结果的准确性和可靠性，对xxxx囊检查的方法适用性试验进行了考察，现将测定结果报告如下：
1. 供试品：xxxx胶囊三批
批号：20151001 20151002 20151003
2. 培养基：
胰酪大豆胨液体培养基（150629） 胰酪大豆胨琼脂培养基（150611）
沙氏葡萄糖液体培养基（150821） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（150827）
PH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲溶液（140725） 麦康凯液体培养基（150911）
麦康凯琼脂培养基（150907） 胰酪大豆胨肉汤对照培养基（135026-201401）
胰酪大豆胨琼脂对照培养基(135025-201402) 麦康凯琼脂对照培养基（135009-201102）
沙氏葡萄糖肉汤对照培养基（1305008-201102）沙氏葡萄糖琼脂对照培养基（135013-201001）
麦康凯液体对照培养基（135030-201501）
以上培养基均由中国食品药品检定研究院提供。
3. 菌种：
菌落计数用菌用：
金黄色葡萄球菌 白色念珠菌
枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌
黑曲霉 铜绿假单胞菌
控制菌检查用菌种：大肠埃希菌
以上菌种均由中国食品药品检定研究院提供。
4. 所用仪器：
双人单面垂直净化工作台BJ-2CD型 编号ZB-HY-174（上海博迅实业有限公司）
净化工作台 SB-JC-IA型 编号ZB-HY-023（上海博迅实业有限公司）
生化培养箱 SPX-250B-Z型 编号 ZB-HY-080（上海博迅实业有限公司）
生化培养箱 SPX-250B-Z型 编号 ZB-HY-081（上海博迅实业有限公司）
生化培养箱 SPX-250B-Z型 编号 ZB-HY-172（上海博迅实业有限公司）
生化培养箱 SPX-250B-Z型 编号 ZB-HY-173（上海博迅实业有限公司）
调速多用振荡器 HY-4型 编号ZB-HY-087（金坛市岸头国瑞实验仪器厂）
立式压力蒸汽灭菌器 YXQ-LS-100A型 编号ZB-HY-175（上海博迅实业有限公司）
手提式电热灭菌锅 YX280B型 编号ZB-HY-003（上海三申医疗器械有限公司）
5.环境要求：微生物限度室在C级条件下的A级环境进行，试验环境达到无菌检查的要求，检验全过程严格遵守无菌操作，防止微生物污染，
防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
6. 微生物计数
按照中国药典2015年版微生物限度检查法进行微生物计数的方法适用性试验及菌落计数。
6.1 菌液制备
（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30~35℃培养18~24小时，
取此培养液1ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数不大于100cfu/ml，见表1。
（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20~25℃培养2~3天，取此培养液1ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌
氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-6，使菌数不大于100cfu/ml，见表1。
（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面培养基上，20~25℃培养5~7天，使大量的孢子成熟，加入3~5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80
的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，振摇或用接种针将孢子洗脱。然后，用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管吸
出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子
悬液。
6.2 培养基的适用性检查
6.2.1胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基
分别取不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，注入无菌平皿中，立即倾入胰酪大豆胨琼脂培养基；30~35℃培养不超过三天。分别取不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，注入无菌平皿中，立即倾入沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌制备2个平皿，混匀，凝固，20~25℃培养不超过五天，计数。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。结果见表2。
结论：被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值均在0.5-2范围内，该培养基的适用性检查符合规定。
6.2.2胰酪大豆胨液体培养基
将不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种至胰酪大豆胨液体培养基试管中，30~35℃培养不超过三天。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。结果见表3。
结论：被检培养基管与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长良好，该培养基的适用性符合规定。
6.2.3麦康凯液体培养基
6.2.3.1 麦康凯液体培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于麦康凯液体培养基和麦康凯液体对照培养基试管中，在42~44℃培养24~48小时，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长良好，结果见表4。
6.2.3.2 麦康凯液体培养基抑制能力检查
分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基和麦康凯液体对照培养基试管中，在42~44℃培养24~48小时，被检培养基管内试验菌未生长，结果见表4。
6.2.4麦康凯琼脂培养基
6.2.4.1 麦康凯琼脂培养基促生长能力检查
取大肠埃希菌0.1 ml涂布于麦康凯琼脂培养基和麦康凯琼脂对照培养基上，在30~35℃培养18~72小时，被检培养基上大肠埃希菌的菌落大小、形态特征、与对照培养基一致，结果见表4。
6.2.4.2麦康凯琼脂培养基指示特性检查
取大肠埃希菌0.1 ml涂布于麦康凯琼脂培养基和麦康凯琼脂对照培养基上，在30~35℃培养18~72小时，被检培养基上大肠埃希菌的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等与对照培养基一致，结果见表4
结论：被检培养基上的生长显示与对照培养基一致，该培养基的适用性符合规定。
6.2.5沙氏葡萄糖液体培养基
6.2.5.1沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的白色念珠菌于沙氏葡萄糖液体培养基和沙氏葡萄糖肉汤对照培养基试管中，在20~25℃培养2~3天，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长良好，结果见表5。
结论：被检培养基上的生长显示与对照培养基一致，该培养基的适用性符合规定。
6.3 供试液制备：
取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（≤45℃）至100ml，振摇溶解使成1:10的供试液。
6.4 试验方法
（1）菌液对照组：取1ml菌液加入稀释液至100ml，另取1ml注入培养基，培养。采用平皿计数法。
（2）供试品对照组：取1ml供试液，注入培养基，培养。采用平皿计数法。
（3）试验组：将1ml菌液加入至制备好的供试液中，另取1ml注入培养基，培养。采用平皿计数法。
进行了3次独立的平行试验，并分别计算试验组菌落数减去供试品对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值。测定结果见表9。
6.5 测定结果
按照中国药典2015年版微生物限度方法适用性试验，该供试品对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值均在0.5~2范围内。采用平皿法可进行本品的微生物检查。
7. 大肠埃希菌
按照中国药典2015年版微生物限度检查法进行控制菌的检查方法适用性试验及检查。
7.1 菌液制备：接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30~35℃培养18~24小时，取此培养液1ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数不大于100cfu/ml。
7.2.2供试液的制备：取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（≤45℃）至100ml，药物摇匀溶解使成1:10的供试液。
7.2.3试验方法
（1）试验组
分别取供试液10ml，加到胰酪大豆胨液体培养基100ml中，重复两份，其是一份作为供试品组，另一份再加入大肠埃希菌不大于100cfu作为试验组；另取大肠埃希菌不大于100cfu，加到胰酪大豆胨液体培养基100ml中（不加供试液）作阳性对照，30~35℃培养18~24小时。取上述培养物1ml接种至麦康凯液体培养基中，42~44℃培养24~48小时，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基上，置30~35℃培养18~72小时，观察结果，见表7。
（2）阴性对照组
取胰酪大豆胨液体培养基100ml，加入PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液10ml作为阴性对照，30~35℃培养18~24小时，取上述培养物1ml接种至麦康凯液体培养基中，42~44℃培养24~48小时，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基上，置30~35℃培养18~72小时，观察结果，见表6。
由表6可见，试验组可检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出，本法适用于本品的控制菌检查。
8. 结论
根据上述试验结果，本品的微生物检查可采用平皿法，控制菌检查采用常规法测定即可。
三批样品测定：
8.1 取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml使成1:10的溶液，稀释成1:101，1:102，1:103稀释级。取各稀释级供试液1ml，置直径为90mm的无菌平皿中，然后注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每培养基各制备2个平板，平板计数。
阴性对照试验：
另取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，取1ml，置无菌平皿中，注入上述两种培养基中，混匀，凝固，倒置培养。每种培养基各制备2个平板。样品测定结果见表8。
8.2大肠埃希菌测定
取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（≤45℃）至100ml，振摇溶解使成1:10的供试液。
（1）样品测定：取样品的供试液10ml，加到100ml胰酪大豆胨液体培养基中培养18~24小时。
（2）阳性对照试验：取样品的供试液10ml，取大肠埃希菌10-6稀释液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养18~24小时。
（3）阴性对照试验：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，经培养18~24小时。
取上述培养物1ml接种至麦康凯液体培养基中，42~44℃培养24~48小时，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基上，置30~35℃培养18~72小时，观察结果，见表7。
不同试验菌回收率测定结果如下：
总结：
通过对不同培养基的适用性实验分析，本品的微生物检查可采用平皿法，控制菌检查采用常规法测定，就可以满足该产品出厂检验需求。
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