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干货|固相萃取篇02-非极性相互作用，碳系吸附剂选择原则。

bencen

2019/02/06

私聊

分离/萃取

我们知道固相萃取理论其实同样适合我们的色谱柱，我们可以将固相萃取小柱理解为一根柱效更低的色谱柱，但因为填料较少，柱效较低，一般实验人员只将固相萃取柱作去杂、富集工具使用。既然固相萃取是一种吸附与解吸附的技术，实验人员首先要了解的是其相关的力，才能更好地应用固相萃取小柱。
固相萃取作用力主要包含以下四种：①非极性相互作用、②极性相互作用、③离子相互作用、④次级相互作用。

非极性相互作用（疏水相互作用）：主要发生在吸附剂烃基及目标物烃基间的作用力。其成因是分子的瞬间偶极与瞬间诱导偶极之间的作用力。具体原理看图更好理解：

图a，一般情况非极性分子正负电荷重心重合；
图b，原子核和电子运动导致电荷重心瞬间偏移，出现瞬间偶极（椭圆左正右负）；
图c，由于分子出现瞬间偶极，相邻的正负电荷重心重合的分子被相关的正负偶极吸引，引起异极相邻，产生作用力，这是瞬间诱导偶极，产生相关的力，从而发生吸附。

以非极性作用力为主要作用力的固相萃取填料有：C18、C8、C2、C1、苯基柱、环己基、CN（同时具备非极性、极性相互作用力）、HLB（同时具备非极性、极性相互作用力）等。由C18到C1，随着碳链慢慢变短，填料极性逐渐变大，C2极性比CN稍低。HLB为亲水亲油平衡柱，属于一种聚合物吸附剂，我们会在将来对这类聚合物填料进行讨论及汇总。
大多数有机化合物都含非极性基团，因而吸附剂可以通过非极性相互作用吸附目标物。我们在挑选溶解目标物的溶剂时，应尽可能选择可接受的（能溶解目标物），极性较强的溶剂（例如水、含有少量有机相的水等等）。这是因为低极性溶剂对目标物具有一定溶解性，且与吸附剂有竞争作用，会使吸附剂与目标物之间的非极性作用力被破坏，导致吸附剂无法有效吸附。而在洗脱时，通过低极性溶剂破坏吸附剂与目标化合物的非极性作用力，即可完成洗脱。

在非极性相互作用填料中，C18是发展较早的一种固相萃取填料。一般通过硅胶与氯硅烷或甲氧基硅烷反应制得：
Silica-OH+ClSi(CH₃)₂(CH₂)₁₇CH3→Silica-O-Si(CH3)2(CH2)17CH3
+HCl
由于空间位阻的存在，在实际的填料制备过程，并非所有硅胶都会发生反应，未反应的硅胶令许多硅羟基裸露在外。(如下图所示，红圈表示未反应的硅羟基，长链代表完成键合的C18)，裸露的硅羟基会与极性较大的组分产生吸附，如果被吸附物是醇或者胺，则这种吸附一般是以氢键的方式进行。为了防止残留硅羟基对实验结果的影响，人们利用三功能团硅烷化试剂对已键合好的材料进行“封端”处理，表面残留的硅羟基就被惰性了（我们可以简单理解为将裸露的硅羟基反应掉）。所以市面上有“封端”C18固相萃取柱及“不封端”C18固相萃取柱。（色谱柱也一样）

我们的目标物，就如上图的六角形一样，通过疏水相互作用（非极性相互作用）被C18填料吸附住。（C8、C2、苯基、CN等柱与C18填料的区别在于C18长链更换成C8\C2\苯基或CN）。

那我们该如何选择固相萃取填料呢？这需要从我们的填料和分析物开始思考。实际情况需要具体情况具体分析，非极性目标物选择非极性相互作用填料、极性目标物选择极性相互作用填料。非极性作用太强无法有效洗脱，适当选择更高极性的填料（如C8\C2\CN等等）、含有特殊基团（如苯环）较多的物质，还可选择苯基柱。当化合物在溶剂中为离子态，此时可以使用离子型交换柱，或通过调节pH值抑制化合物离子化，然后根据化合物的极性确定使用正相填料或反相填料。
以下，先介绍反相固相萃取填料的选择流程及注意事项，正相及离子型交换填料请待下回分解。
1.查阅C18、C8、C2、苯基柱、CN等填料的说明书，确定填料的可耐受pH范围。
2.需要查阅我们相关分析物的pKa，确定我们的分析物在溶剂中是以何种形态存在的，分子态还是离子态，还是共存。（这里有查找方法：→干货|固相萃取篇01-了解PH、PKA）
3.当分析物为非极性，在溶剂中分子态，若考虑使用C18填料进行吸附，建议使用“封端”C18，这是因为分析样品基质较为复杂，同时杂质也较多，在这种情况下选择“不封端”C18填料，会对极性杂质进行吸附，降低了净化效果。若吸附太强无法洗脱，可以提高吸附剂极性，选择C8等吸附剂。
4. 当分析物既有极性也有非极性，分子态时，由于“封端”C18无法对极性成分进行保留，此时，“不封端”C18填料的裸露硅羟基可发生一定的吸附作用，虽然稍微牺牲除杂效果，但可提极性成分的吸附效率。此外，还可以选择具有一定极性相互作用的C2、CN等固相萃取柱。
5.倘若我们只有不封端的C18固相萃取柱怎么办？
在这种情况下，实验人员应该想办法将硅羟基的次级相互作用降低。当填料硅羟基带负电荷，目标物带正电荷，次级相互作用主要为能量较大的离子相互作用。当硅羟基未带电荷，次级作用将下降至最小。对于填料硅羟基而言，pH值越大，其解离程度越大，一般pH大于4.0，硅羟基带有明显负电荷。而分析物带电情况则十分复杂，因而最理想的pH应为硅羟基，分析物均不带电荷。而氢键、偶极偶极相互作用这两种次级相互作用较难避免，若实在无法满足净化要求，只能更换其他类型填料了。

6.固相萃取柱保留目标物模式下的使用方法

6.1非极性相互作用固相萃取柱的活化与平衡。纯甲醇活化，纯水或样品溶剂平衡。甲醇活化的作用是使吸附剂上的功能基团展开，去除吸附剂的杂质。并且，非极性填料若直接与水接触，由于它们互不相溶，以压力压下，其接触效果并不好，以甲醇活化后，甲醇可引导纯水或样品溶剂与填料充分接触，纯水及样品溶液再加入，可令样品溶液有更大的接触面积，增加吸附效率。
6.2非极性相互作用固相萃取柱的上样。溶解样品的溶剂，极性记得要较大，例如用水。低极性溶解会破坏非极性作用力，这样目标物就吸不住啦。
6.3淋洗和洗脱。因为淋洗只是为了清洗管壁等作用，这一部分不能令目标物被洗脱，可用纯水或者带有少量甲醇的水溶液淋洗。洗脱是为了尽量把目标物带出，建议使用带有适量有机溶剂的水溶液、甲醇或者极性更低的溶剂把非极性相互作用力打破，以达到洗脱目的。

7.固相萃取柱保留干扰物模式下的使用方法
干扰物被保留，而收集洗出液。

7.1 使用样品溶剂一致的溶剂活化/平衡；
7.2加入样品溶液，弃去前部分样品溶液，目的是为了弃去活化/平衡的溶剂；
7.3收集流出液。
8.影响固相萃取效率的因素
8.1 吸附剂，前文提及的，因为吸附剂对目标化合物的吸附力原理不一样导致的；
8.2 洗脱溶剂，洗不掉或在洗脱前就解吸附，直接影响回收率；
8.3 保留体积，过多体积样品，和过浓目标物，容易导致固相萃取吸附过载，应该避免。
8.4 流速，流速的控制对固相萃取至关重要，流速过大将引起固相萃取柱的穿漏，流速太小则处理速度太慢。柱预处理过程中流速适中，保证溶液充分湿润吸附剂即可，上样和洗脱过程则要求流速尽量慢些，以使分析物尽量保留在柱内或达到完全洗脱，否则会导致分析物流失，影响回收率的大小。尤其离子交换过程，进行比较缓慢，应采用较低的流速(0.5-2.0mL/min)。
最后，汇总一下非极性相互作用吸附剂的应用范围吧。

反相固相萃取柱	功能基团	保留机制	应用
C18	十八烷基	强非极性相互作用	该疏水反相填料可保留大多数非极性化合物和水性基质中的大多数有机分析物，可用于脱盐。
C18（不封端）	十八烷基	非极性相互作用（主）、次级相互作用（辅）	该疏水反相填料可保留大多数非极性化合物和水性基质中的大多数有机分析物，可用于脱盐。
C8	辛基	中等非极性相互作用	对非极性物质比 C18 固定相的保留相对弱一些，若C18与目标化合物无法有效洗脱，可以尝试换C8
C2	乙基	非极性相互作用（主）、极性相互作用（辅）	C18、C8均无法有效洗脱，可尝试C2，C2 的极性比氰基稍低。
CN	氰基	非极性相互作用（主）、极性相互作用（辅）	C18、C8均无法有效洗脱，可尝试CN，是水溶性样品提取的理想选择，在水基质和有机基质中均有保留
PH	苯基	中等非极性相互作用	极性与C8类似，由于具有π-π相互作用，芳香环上的电子云增强了对共轭的或带芳香环的化合物的保留。
CH	环己基	中等非极性相互作用	对某些分析物具有独特的选择性。若用作非极性吸附剂，CH 与C2 吸附剂具有相当的极性。当非极性吸附剂如C18、C8 或C2 的选择性不佳时可以选用。
C1	甲基	非极性相互作用	吸附剂采用了封端处理，屏蔽了极性活性硅羟基，因此这种固定相仍然可以实现对极性和多官能团化合物的保留和洗脱，C1是所有烷基官能团键合相中对非极性化合物保留最小的。

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