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泽泻多糖的提取工艺的优化

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2019/08/26
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中药/天然药检测

摘要：
目的：探索提取温度、液固比和提取时间对泽泻多糖产率的影响，得到提取泽泻多糖最优工艺条件。方法：用均匀设计实验优化泽泻多糖的提取工艺，用苯酚硫酸法测出每次实验所得多糖的纯度，再求得每次实验纯多糖的得率，然后应用回归分析的方法分析实验得出的数据，以纯多糖的得率为指标，对提取温度、液固比、提取次数和提取时间3个因素进行分析，得出最佳工艺条件，并进行验证。结果：实验得出茵陈多糖的最佳提取条件是：提取温度100℃、提取时间135 min、提取液固比40:1。结论：验证实
验平均得率为8.83%，预测值是8.28%，二者很接近，说明我们得到的最佳工艺条件是可靠的。
1前言
泽泻为泽泻科植物泽泻Alsima orientalis(sam.)Juzep.的干燥块茎，分布在中国、韩国和日本等国。性味甘、淡、寒，归肾、膀胱经。作为常用中药，是六味地黄丸、龙胆泻肝丸、五苓散等临床常用重要方剂的主要组成。具有利水渗湿，泄热，化浊降脂等功效，用于治疗小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛，高脂血症等症。
1.1泽泻的化学成分
泽泻中的三萜类化合物主要有：泽泻醇A、泽泻醇A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯、表泽泻醇A、11-去氧泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇C-23-乙酸酯、16，23-氧化泽泻醇E、泽泻醇F、阿里泽泻醇A和阿里泽泻醇B等原萜烷型四环三萜。从生物途径归纳，三萜类都是由 23- 泽泻醇 B 衍生而来。中药泽泻中获得的倍半萜类化合物多数为愈创木烷型。现分离到的倍半萜化合物主要有：泽泻醇，环氧泽泻烯，Orientalol A，B，C，Sulfooriental A，B，C，D。Yamaguchi等首次从泽泻鲜品中分离出一个贝壳杉烷型四环二萜类化合物，并最终确定了绝对构型为(-)-16R-ent-kauranre-2,12-doine。彭国平等从泽泻中分离出两个新的贝壳杉烷型四环二萜类化合物：泽泻二萜醇(Oriediterpenol)及泽泻二萜醇苷 (Oriediter-penoside)。
泽泻除了萜类成分外，此外，泽泻还含挥发油、多糖、蒽醌、磷脂、蛋白质及淀粉等成分。如胡萝卜素-6-硬酸脂、β-谷甾醇、三十烷、正二十烷、卫矛醇、挥发油(内含糖醛)、少量生物碱、天门冬素、脂肪酸、树脂、植物凝集素、大黄素、酸性多糖，胆碱，以及大量淀粉、蛋白质、氨基酸和钾、钙、镁等金属元素。
1.2　泽泻的药理作用
现代研究表明，泽泻有明显的利尿，抑制肾结石形成，降血压，降血脂及抗动脉粥样硬化，抗脂肪肝，抗肾炎活性和调节免疫等作用。
1.3立题依据
多糖具有多种生物活性, 具有提高免疫, 降血糖，抗肿瘤, 抗病毒等功能, 被认为是构成生命的四大基本物质之一。由于其独特功能和较低的毒性, 多糖类化合物在抗衰老、抗病毒和肿瘤治疗、糖尿病治疗等方面有良好的应用前景。另外,多糖可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性, 可用于抑制脂质氧化, 稳定酸性饮料, 也可作为乳化剂等, 在食品中的用途十分广泛。
目前已发现的天然多糖有几百种，其中植物多糖对肿瘤治疗及调节机体免疫力效果显著，同时还有治疗肝炎、抗衰老等药理作用，且毒副作用很小。由于泽泻的药理作用显著，而关于泽泻多糖研究的文献很少，因此对于泽泻多糖的研究也具有很大的意义。开发泽泻多糖产品，首先需要把多糖从泽泻中提取出来。笔者决定对泽泻多糖的提取工艺进行研究，对其提取条件进行优化，从而为泽泻多糖的深入开发利用提供实验依据。本课题我们就重点探讨泽泻多糖的最佳提取条件，通过对泽泻多糖提取过程中影响泽泻多糖产率、纯度的因素进行单因素实验，然后进行均匀设计实验，用线性回归的分析方法分析实验得出的数据，寻找泽泻多糖的最优化工艺条件。
1.4提取方法的确定
提取植物多糖的方法有多种，一般是采用水提醇沉法，采用水提醇沉法提取，可防止引起糖苷键的断裂。李小凤等通过单纯的水提醇沉法对泽泻多糖进行了提取和含量测定。此外,很多研究对多糖的水提醇沉工艺做了优化，如朱秀灵等采用超声波辅助提取银杏叶多糖；缪建等采用酶法结合水提醇沉法提取银杏叶多糖；金汝城等采用均匀设计优化超声波法提取黄芪多糖。由于实验设备有限，本实验采用水提醇沉法对泽泻多糖进行提取。
2　　实验材料
2.1实验仪器
FA2104N型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）
HH-1数显恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂）
80-2离心机(上海荣泰生化工程有限公司)
RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）
GZX-9070电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）
DZF-6050真空干燥箱(巩义市予华仪器责任有限责任公司)
SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定市新区阳光科教仪器厂）
BCD-223MT冰箱（河南新飞电器有限公司）
722可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）
24目，100目标准筛（浙江上虞市华丰五金仪器有限公司）
2.2实验材料和试剂
泽泻（河北省安国药材市场）
无水乙醇（分析纯，天津市美琳工贸有限公司）
蒸馏水（实验室自制）
葡萄糖（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）
苯酚（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）
浓硫酸（分析纯，北京化工厂）
３实验方法
3.1泽泻粗多糖的提取流程
将预备好的泽泻放入70℃真空烘箱中干燥2h，粉碎取过24目筛，不可过100目筛的粉末，装在密封袋中置于干燥器中备用。
泽泻多糖提取的实验流程如下：
精密称定已制备的泽泻粉末5.000g于500mL圆底烧瓶中，加入规定液固比的蒸馏水，用恒温水浴锅T℃水浴加热不同时间，先用脱脂棉过滤得粗滤液，然后用布氏漏斗抽滤粗滤液，通过旋蒸仪旋转蒸发将所得滤液浓缩至约10mL，加95%乙醇30mL，置具塞锥形瓶中，冰箱4℃放置约18h，然后用10mL试管离心（3000rpm，10min），弃去上清液，得沉淀，于50℃、0.099MPa真空干燥箱中放置3.5h后，关闭电源，真空放置过夜。然后，将所得沉淀与离心管一起称重，通过差量法计算多糖产率。
其中，液固比、水浴温度T、提取时间t及提取次数根据实验过程中考察因素的改变，作相应更改。
粗多糖产率=粗多糖质量／泽泻样品质量×100%
3.2　泽泻纯多糖含量的测定
本课题中，泽泻提取工艺最佳条件分析中所用的是纯多糖含量，粗多糖的数值只是作为参考数值。本实验中是通过苯酚-浓硫酸反应使多糖显色，在紫外可见分光光度计490nm处测得吸光度，然后通过将数据代入当天测得的标准曲线中，计算出相应多糖浓度，从而计算出不同提取条件下泽泻中纯多糖的含量。
3.2.1　标准曲线的绘制
标准液的配制：称取葡萄糖0.1259g于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀得1.259g/L的储备液，分别精密量取储备液1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL，置于25mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀。则得五个不同浓度的标准液。
配制5%苯酚溶液：称取苯酚1.2508g于烧杯中，用加热至约50℃的蒸馏水溶解，转移至25mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，避光保存以备用。
标准曲线的绘制：取2mL移液管，分别取2mL蒸馏水和五个标准溶液于六根具塞试管中，再用移液枪移取1mL5%的苯酚溶液，快速加入上述具塞试管中，充分混匀，用5mL移液管取5mL浓硫酸快速加入上述试管中，盖好试管塞，充分摇匀。从放入沸水浴中计时，沸水浴15min，冷水浴10min，室温放置5min（六个溶液之间间隔3min加硫酸）。将上述反应30min后的溶液分别在490nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以葡萄糖标准溶液C(Co=50.36)为横坐标，绘制标准曲线。（见图1-1）
标准曲线的线性范围为：0.10072×10^-4g/mL ~0.50360×10^-4g/mL
曲线方程：A=0.0165C-0.0216，相关系数：r=0.9998

图1-1 标准曲线

3.2.2　苯酚-浓硫酸法测多糖含量
分别取不同提取条件下所得粗多糖0.040g于小烧杯中，加少量温水搅拌使其溶解，转移至250mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。使用前用布氏漏斗抽滤，滤去不溶物，得澄清滤液。然后用2mL移液管分别移取2mL上述滤液于具塞试管中，再用移液枪移取1mL 5%的苯酚溶液，快速加入上述具塞试管中，充分混匀，用5mL移液管取5mL浓硫酸快速加入上述试管中，充分摇匀，盖好试管塞。沸水浴15min，冷水浴10min，室温放置5min，反应完全后在490nm处测定其吸光度，每次需配制空白对照用来校正可见分光光度计。将测得的吸光度带入标准曲线方程中计算出所配溶液的多糖浓度，进而可计算出纯多糖的产率。
3.2.3　纯多糖产率的计算
纯多糖产率=（纯多糖浓度×体积×粗多糖质量）／（粗多糖测样量×泽泻质量）×100%
3.3　单因素实验
3.3.1　液固比对泽泻多糖提取率的影响
考察液固比，是为了能够在使用较少溶剂的情况下提取出最多的多糖，这不光能够减少工业生产中单位产量水的使用量，同样也为多糖提取液后期处理减少了时间和成本，具有重要的经济和生态效益。在结合前人相关中药材多糖提取实验的基础上，确定考察液固比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。纯多糖产率见表3-1。

表3-1　　液固比对多糖提取率的影响

提取温度	80℃	提取时间		2.5h	提取次数		1
液固比（mL/g）	10:1		20:1		30:1	40:1	50:1
多糖产率(%)	3.38		3.46		5.43	7.87	6.81

3.3.2　提取温度对泽泻多糖提取率的影响
中药材提取过程中，温度是极其重要的条件。通过查阅文献及综合各方面考虑，确定提取温度为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。多糖产率见表3-2。

表3-2　　提取温度对多糖提取率影响

液固比	20:1	提取时间		2.5h	提取次数		1次
提取温度	60℃		70℃		80℃	90℃		100℃
多糖产率(%)	1.81		2.87		4.55	5.75		9.57

3.3.3　提取时间对泽泻多糖提取率的影响
通过查阅文献，本实验确定考察时间为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h。多糖产率见表3-3。

表3-3 提取时间对多糖提取率的影响

液固比	20:1	提取温度		80℃	提取次数			1次
提取时间（h）	0.5		1		1.5	2	2.5	3	3.5
多糖产率（%）	3.57		3.38		4.75	5.04	5.00	4.55	5.15

3.3.4　提取次数对泽泻多糖提取率的影响
众所周知，在最合适的料液比、提取温度、提取时间条件下，提取次数越多，药物的有效成分在中药材中溶出的就会越多，提取率相应就会越高，但提取次数决定操作成本，提取次数越多，成本越高，且工艺用水量大。所以根据前人提取数据，将提取次数定为1次、2次、3次。多糖产率见表3-4。

表3-4 提取次数对多糖提取率的影响

提取温度	80℃	提取时间		2.5h	液固比	20:1
提取次数	1		2		3
多糖产率（%）	3.46		5.71		8.68

3.4 均匀设计实验
3.4.1　均匀设计实验方案
在泽泻（均为5g干粉）多糖提取工艺中，我们要考察的主要因素有：提取温度、料液比及提取时间三个因素。根据单因素实验结果确定各因素的取值范围：提取温度X₁ :55℃~100℃；料液比X₂：1:15~1:60：提取时间X₃：1.5h~3.75h。再根据各种因素的取值范围、试验精度要求，按提取温度间隔5℃，液料比间隔5，提取时间间隔0.25h，设计出一个3因素10水平的均匀设计表。根据均匀设计表中所列的提取条件，按照泽泻粗多糖的提取流程，对泽泻粗多糖进行提取，并计算其产率。（见表4-1）提取得到粗多糖并测定多糖纯度，进而求得纯多糖产率。

表4-1　　均匀设计实验数据

条件
编号

温度（℃）

料液比

（g/mL）

时间（min）

粗多糖产率(%)

纯多糖产率(%)