浅谈LC-MS/MS药动学方法学考察中的全血稳定性实验
利用液质技术测定药动学时，方法学考察是至关重要的一步，除了比较经典的精密度试验、样品稳定性试验、溶液稳定性实验、专属性试验、基质效应考察、回收率实验和长冻样品稳定性试验等，大多实验者容易忽略的是全血稳定性实验。全血稳定性实验，顾名思义是指全血从动物体内取出，放置一段时间是否会影响药物的浓度。而大多数药物由于自身性质的原因会导致分解，进而影响测定特定时间点下的药物血浆浓度。因此，对于不稳定的药物，我们不仅需要在全血离心得到血浆后考虑药物的稳定性，还需要考察药物在全血中的稳定性。
药物在全血中被转化掉了，也就是biotransformation。全血或血浆中的转化一般会发生在具有易水解位点的化合物，如具有酯键或酰胺键的化合物等。原因很简单，全血或血浆中含有水解酶。要搞清楚你的化合物是不是被水解掉了，也很简单。如果你的血是EDTA抗凝的，那么水解反应这个原因就不可能了，因为水解酶要发挥作用是需要金属离子（镁离子）的，而EDTA可以螯合掉金属离子（镁离子）。因此你只需要比较一下肝素钠和EDTA两种抗凝剂的孵育结果就行了。如果肝素钠不下降，EDTA下降就是这个原因了。如果都下降，就不是这个原因了。当然，如果真的是水解反应所造成的话，一般都应该能同时观察到全血和血浆的浓度下降。
我们举一个例子为大家演示全血稳定性实验的操作步骤。首先购买无菌抗凝大鼠全血，要求大鼠来源健康，全血由EDTA抗凝。见下图。全血中的红细胞易破裂，应严禁将全血冻存，且远离冰箱壁等低温源。保存期间适时摇晃全血瓶，使红细胞均匀吸收养分和氧气，防止变黑。储存条件：2-6℃保存，无菌取用。
我们的分析物结构不稳定，在水中和甲醇中易水解，主要水解产物我们也购买了标准品，打算利用液质技术同时检测分析物和水解产物的浓度。而分析物由于结构的原因，对pH要求较大，即应在pKa范围内才能稳定存在。因此我们的实验目的也清晰了很多，建立方法改善药物不稳定因素，尽量做到测定药物浓度为真实浓度。那么我们的方法就是在取血前，在抗凝管内加少量酸溶液，改善pH，进而使药物稳定存在。此处实验我们尝试了不同浓度和体积的甲酸、乙酸 ，以及不同稀释液：水、生理盐水、PBS等。最终选择的是10%乙酸的PBS溶液，1 mL全血对应50 mL即可保证分析物稳定不水解。
实验开始，我们设计了低、高浓度的分析物在空白血浆、加酸调pH后的血浆条件下，分别在0,1,2,4小时37℃水浴保存后，用4000rpm离心机离心操作将血浆取出，然后将血浆沉淀蛋白，取上清进样分析。见下图。此处需要注意的是全血不能用涡旋仪涡旋，否则红细胞会破裂，我们选用的是摇床，将加了分析物的全血摇匀。见下图。
最终实验结果也是符合我们的预期，文章结尾依然要感谢仪器信息网为我们提供原创大赛平台，互相学习，互相进步！Fighting！
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LC-MS实验瓶颈的突破与优化
