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动物疫病实验室检验采样方法

苑在掌心

2020/09/30
鹤壁农检联合队

前处理综合讨论

动物疫病实验室检验采样方法

1范围

本方法适用动物疫病诊断实验室的样品采集方法，适用于病因(原)学、病理组织学、血清学、免疫学等实验室检验所需样品的采集。

2样品采集的一般原则和采集前的准备

2.1　样品采集所遵循的一般原则

2.1.1　凡发现患畜(包括马、牛、羊及猪等)有急性死亡时，如怀疑是炭疽，则不可随意解剖，应采取患畜的血液，万不得已时局部解剖作脾脏触片的显微镜检查。只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。

2.1.2　采取病料的种类，根据不同的疾病或检验目的，采其相应的脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料；进行流行病学调查、抗体检测、动物群体健康评估或环境卫生检测时，样品的数量应满足统计学的要求。采样时应小心谨慎，以免对动物产生不必要的刺激或损害和对采样者构成威胁。在无法估计病因时，可进行全面的采集。检查病变与采集病料应统筹考虑。

2.1.3　内肌病料的采取，如患畜已死亡，应尽快采集，最迟不超过6h。

2.1.4　血液样品在采集前一般禁食8h。

2.1.5　采样时应考虑动物福利，应做好人身防护，采样人员必须穿戴必要的个人防护用品，严防人畜共患病感染。

2.1.6　应防止污染环境，防止疫病传播，做好环境消毒和病害肉尸的处理。

2.1.7 采样人员必须是兽医技术人员，熟悉采样器具的使用，掌握正确采样方法。

2.2　器械

2.2.1 所用器械

2.2.1.1 动物检疫器械箱，保温箱或保温瓶，解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，碘酒棉，注射器及针头等。

2.2.1.2 样品容器（小瓶、平皿、离心管及易封口样品袋、塑料包装袋等）。

2.2.1.3 试管架，铝盒，瓶塞，无菌棉拭子，胶布，封口膜，封条,冰袋等。

2.2.1.4 记录和防护材料

不干胶标签、签字笔、圆珠笔、记号笔、采样单、记录本等；口罩、一次性手套、乳胶手套、防护服、防护帽、胶靴等。

2.2.1.5 采样刀剪等器具和样品容器须无菌。

2.2.2 所用器械的消毒

刀、剪、镊子等用具煮沸消毒30min，使用前用酒精擦拭，用时进行火焰消毒。器皿(玻制、陶制等)经103kPa高压30min，或经160C干烤2h灭菌；或放于0．5％～1％的碳酸氢钠(NaHCr~)水中煮沸10min～15min，水洗后，再用清洁纱布擦干，保存于酒精、乙醚等溶液中备用。注射器和针头放于清洁水中煮沸30min。一般要求使用“一次性”针头和注射器。采取一种病料，使用一套器械与容器，不可用其再采其他病料或容纳其他脏器材料。采过病料的用具应先消毒后清洗。检查过传染性海绵状脑病的器械要放在2mol／L的氢氧化钠(NaOH)溶液中浸泡2h以上，才可再使用。

3　样品的采集

3.1　血液

3.1.1　采血部位

大的哺乳动物可选用颈静脉或尾静脉采血，也可采胫外静脉和乳房静脉血。毛皮动物小量采血可穿刺耳尖或耳壳外侧静脉，多量采血可在隐静脉采集，也可用尖刀划破趾垫0.5cm深或剪断尾尖部采血。啮齿类动物可从尾尖采血，也可由眼窝内的血管丛采血；猪可从耳缘静脉、前腔静脉或心脏采血，牛可从尾静脉、颈静脉采血，羊可从颈静脉采血，兔可从耳背静脉、颈静脉或心脏采血。禽类通常选择翅静脉采血，也可通过心脏采血。

3.1.2　采血方法

对动物采血部位的皮肤先剃毛(拔毛)，75％的酒精消毒，待干燥后采血，采血可用针管、针头、真空管或用三棱针穿刺，将血液滴到开口的试管内。禽类等的少量血清样品的采集，可用塑料管采集。用针头刺破消毒过的翅静脉，将血液滴到直径为3mm～4mm的塑料管内，将一端封口。

3.1.3　采血种类

3.1.3.1　全血样品

进行血液学分析，细菌、病毒或原虫培养，通常用全血样品，样品中加抗凝剂。抗凝剂可用0.1％肝素、阿氏液(见第A.1章)(阿氏液为红细胞保存液，使用时，以1份血液加2份阿氏液)，或枸橼酸钠(3.8％～4％的枸橼酸钠0.1mL，可抗1mL血液)。采血时应直接将血液滴人抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。也可将血液放人装有玻璃珠的灭菌瓶内，震荡脱纤维蛋白。

3.1.3.2　血清样品

进行血清学试验通常用血清样品。用作血清样品的血液中不加抗凝剂，血液在室温下静置2h～4h(防止曝晒)，待血液凝固，有血清析出时，用无菌剥离针剥离血凝块，然后置4℃冰箱过夜，待大部分血清析出后取出血清，必要时经低速离心分离出血清。在不影响检验要求原则下可因需要加入适宜的防腐剂。做病毒中和试验的血清避免使用化学防腐剂(如硼酸、硫柳汞等)。若需长时间保存，则将血清置20℃以下保存，但要尽量防止或减少反复冻融。样品容器上贴详细标签。

3.1.3.3　血浆的采集

采血试管内先加上抗凝剂(每10mL血加柠檬酸钠0.04g～0.05g)，血液采完后，将试管颠倒几次，使血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待细胞下沉后，上层即为血浆。

3.2　一般组织

3.2.1　采样方法

用常规解剖器械剥离死亡动物的皮肤，体腔用消毒的器械剥开，所需病料按无菌操作方法从新鲜尸体中采集。剖开腹腔后，注意不要损坏肠道。

作病原分离用：进行细菌、病毒、原虫等病原分离所用组织块的采集，可用一套新消毒的器械切取所需器官的组织块，每个组织块应单独放在已消毒的容器内，容器壁上注明日期、组织或动物名称。注意防止组织间相互污染。

3.2.2　采样种类

3.2.2.1　病原分离样品的采集

用于微生物学检验的病料应新鲜，尽可能的减少污染。用于细菌分离的样品的采集，首先以烧红的刀片烫烙脏器表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂耳伸人孔内，取少量组织或液体，作涂片镜检或划线接种于适宜的培养基上。

3.2.2.2　组织病理学检查样品的采集

采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放人10倍于组织块的10％福尔马林溶液中固定。组织块厚度不超过0.5cm，切成1cm2～2cm2(检查狂犬病则需要较大的组织块)。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如作冷冻切片用，则将组织块放在0℃～4℃容器中，尽快送实验室检验。

3.3　肠内容物或粪便

肠道只需选择病变最明显的部分，将其中的内容物弃去，用灭菌生理盐水轻轻冲洗；也可烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取内容物，将肠内容物放人盛有灭菌的30％甘油盐水缓冲保存液(见第A．2章)中送检。或者，将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断送检。

从体外采集粪便，应力求新鲜。或者，用拭子小心地插到直肠粘膜表面采集粪便，然后将拭子放人盛有灭菌的30％甘油盐水缓冲保存液中送检。

3.4　胃液及瘤胃内容物

3.4.1　胃液采集

胃液可用多孔的胃管抽取。将胃管送入胃内，其外露端接在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即可自动流出。

3.4.2　瘤胃内容物采集

反刍动物在反刍时，与食团从食道逆人口腔时，立即开口拉住舌头，另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃内容物。

3.5　呼吸道

应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分泌物，蘸取分泌物后立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。常用的保存液有pH7.2～7.4的灭菌肉汤(见第A．3章)或磷酸盐缓冲盐水，如准备将待检标本接种组织培养，则保存于含0.5％乳蛋白水解物的汉克氏(Hanks)液中。一般每支拭子需保存液5mL。

3.6　生殖道

可采集阴道或包皮冲洗液，或者采用合适的拭子，有时也可用尿道拭子采集。

3.7　眼睛

眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，放在灭菌的30％甘油盐水缓冲保存液中送检。有时，也采取病变组织碎屑，置载玻片上，供显微镜检查。

3.8　皮肤

病料直接采自病变部位，如病变皮肤的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。

3.9　胎儿

将流产后的整个胎儿，用塑料薄膜、油布或数层不透水的油纸包紧，装入木箱内，立即送往实验室。

3.10　小家畜及家禽

将整个尸体包人不透水塑料薄膜、油纸或油布中，装入木箱内，送往实验室。

3.11　骨

需要完整的骨标本时，应将附着的肌肉和韧带等全部除在，表面撒上食盐，然后包入浸过5％石炭酸溶液的纱布中，装入不漏水的存器内送往实验室。

3.12　脑、脊髓

3.12.1　全脑、脊髓的采集

如采取脑、脊髓做病毒检查，可将脑、脊髓浸入30％甘油盐水液中或将整个头部割下，包人浸过消毒液的纱布中，置于不漏水的容器内送往实验室。

3.12.2　脑、脊髓液的采集

3.12.2.1　采样前的准备

采样使用特制的专用穿刺针，或用长的封闭针头(将针头稍磨钝，并配以合适的针芯)；采样前，术部及用具均按常规消毒。

3.12.2.2　采样方法

3.12.2.2.1　颈椎穿刺法：穿刺点为环枢孔。将动物实施站立或横卧保定，使其头部向前下方屈曲，术部经剪毛消毒，穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入。将针体刺入蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑脊髓液自动流出或点滴状流出，盛人消毒容器内。

3.12.2.2.2　腰椎穿刺法：穿刺部位为腰荐孔。实施站立保定，术部剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺入，当刺入蛛网膜下腔时，即有脑脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器内。

3.12.2.3　采样数量

大型动物颈部穿刺一次采集量35 mL～70mL，腰椎穿刺一次采集量15mL～30mL。

3.13　液体病料

采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时，用烫烙法消毒采样部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入，吸取内部液体材料，然后将材料注入灭菌的试管中，塞好棉塞送检。也可用接种环经消毒的部位插入，提取病料直接接种在培养基上。

供显微镜检查的脓、血液及粘液抹片的制备方法：先将材料置玻片上，两用一灭菌玻棒均匀涂抹或另用一坡片推抹。组织块、致密结书及脓汁等亦可在两张玻片中间，然后沿水平面向两端推移。用组织块作触片时，持小镊将组织块的游离面在玻片上轻轻涂抹即可。

3.14　乳汁

乳房先用消毒药水洗净(取乳者的手亦应事先消毒)，并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的3～4滴乳汁弃去，然后再采集10mL左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。

3.15　精液

精液样品用人工方法采集，所采样品应包括“富精”部分，并避免加入防腐剂。

3.16　尿液的采集

在动物排尿时，用洁净的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液。采取尿液，宜早晨进行。

3.17　环境

为监测环境卫生或调查疾病，可从遗弃物、通风管、下水道、孵化厂或屠宰场采集有代表性样品。

4　送检样品的记录

送往实验室的样品应有一式三份的送检报告，一份随样品送实验室，一份随后寄去，另一份备案。样品记录至少应包括以下内容：

a) 畜主的姓名和畜禽场的地址；

b) 畜(农)场里饲养的动物品种及其数量；

c) 被感染的动物种类；

d) 首发病例和继发病例的日期及造成的损失；

e) 感染动物在畜群中的分布情况；

f) 死亡动物数、出现临床症状的动物数量及其年龄；

g) 临床症状及其持续时间，包括口腔、眼睛和腿部的情况，产奶或产蛋的记录，死亡情况和时间，免疫和用药情况等；

h) 饲养类型和标准，包括饲料种类；

i）送检样品清单和说明，包括病料的种类、保存方法等；

j）动物治疗史；

k) 要求做何种试验；

1) 送检者的姓名、地址、邮编和电话；

m) 送检日期。

5　样品的运送

所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。如果样品能在采集后24h内送抵实验室，则可放在4℃左右的容器中运送。只有在24h内不能将样品送往实验室并不致影响检验结果的情况下，才可把样品冷冻，并以此状态运送。根据试验需要决定送往实验室的样品是否放在保存液中运送。

要避免样品泄漏。装在试管或广口瓶中的病料密封后装在冰瓶中运送，防止试管和容器倾倒。如需寄送，则用带螺口的瓶子装样晶，并用胶带或石蜡封口。将装样品的并有识别标志的瓶子放到更大的具有坚实外壳的容器内，并垫上足够的缓冲材料。空运时，将其放到飞机的加压舱内。

制成的涂片、触片、玻片上注名号码，并另附说明。玻片两端用细木条分隔开，层层叠加，底层和最上一片，涂面向内，用细线包扎，再用纸包好，在保证不被压碎的条件下运送。

所有样品都要贴上详细标签。

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wccd1

第1楼2020/10/08

最后一天上稿，审批特别严！

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