动物源食品中五氯酚残留量的测定

我是风儿

2021/10/09
农检联合队

私聊

兽药/抗生素检测

动物源食品中五氯酚残留量的测定

1 引言

五氯酚也称五氯苯酚（PCP）是一种重要的防腐剂,它能阻止真菌的生长、抑制细菌的腐蚀作用,长期以来均被用作皮革品和木材的防霉剂，对防治霉菌与一般虫类（如白蚁）均有效。五氯酚酸钠盐（PCP-na）用于消灭血吸虫中间宿主钉螺和防治稗草等，由于其具有较高水溶性，溶于水扩散后对水源土壤造成污染，通过食物蓄积于动物体内，残留在食品中。

五氯酚酸钠降解缓慢，有致癌、致畸、致突变三致反应。长期食用五氯酚污染的食品可能对肝、肾及中枢神经系统造成损害。

2材料和方法

2.1仪器与设备 TSQ Quantis热电液相质谱仪；Milli-Q超纯水机（美国密理博）；冷冻离心机（德国sigma）；均质器（德国IKA）;固相萃取装置。

2.2试剂与材料五氯酚（厂家：坛墨质检；标准编号：91412IA；批号：902010；浓度200μg/mL）、甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；实验材料：Copure(逗点) MAX净化小柱（货号：COMAX360，批号：MO030447）

2.3色谱条件色谱柱ZORBAX Eclipse C18 （3.0*150mm, 1.8μm）；流动相：A：0.05%甲酸；B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1min，40%～75% B；1～7.5 min，75%～95%B；7.5～8min，95%～40% B；8～10min，40%B；流速：0.3mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10μL。

2.4质谱条件电喷雾负离子模式（ESI-）；多反应监测扫描模式（MRM）；条件如表1：

表1 五氯酚多反应监测条件

母离子	子离子	碰撞电压（Collision Energy）
262.7*	262.7	0
264.7	264.7	0
266.7	266.7	0
268.7	268.7	0

带*表示定量离子

2.5标准工作曲线配制将五氯酚液标（200μg/mL）配成20ug/mL标准贮备液，冷冻保存6个月；再将其用50%甲醇水溶液按逐级稀释成(1、2、4、8、10)ng/mL的标准系列工作使用液。

2.6样品溶液的制备称取均质试样2 g（精确到0.01 g），置于50 mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈-水（70%）溶液。均质提取2min；超声提取5 min后于6 000 r/min离心5 min，收集上清液于一具刻度离心管中。离心后的残渣用约6 mL 5%三乙胺的乙腈-水（70%）溶液重复上述提取步骤1次，合并上清液，混匀。净化：提取溶液转入经过预处理的MAX固相萃取柱（预先用使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化）中，以约1滴/秒流速使样品溶液全部通过固相萃取柱，弃去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、 5 mL甲醇、 5mL 2 ％甲酸的甲醇-水溶液淋洗，淋洗液完全通过小柱后，弃去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱5 min以上。以4 mL 8％甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液用干净的15 mL具刻度试管收集， 40℃水浴下吹氮浓缩近干，用50%甲醇水定容至2mL，混匀。溶液以0.22μm有机滤膜过滤，供测定，上机测试。

2.7基质标准工作曲线的绘制称取5份与试样基质相应的阴性样品2.0g，分别加入20ng/mL五氯酚标液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL，按照2.6项下处理，最终得到1、2、4、8、10ng/mL相应基质的标准工作使用液。

3 结果与分析

3.1液相方法优化与典型图谱 GB 23200.92-2016的流动相：甲醇+5mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱如下：

表2 GB 23200.92-2016 流动相梯度

时间（min）	流速（mL/min）	5mmol/L乙酸铵溶液（%）	甲醇（%）
0.00	0.3	60	40
1.00	0.3	0	100
7.00	0.3	0	100
7.50	0.3	60	40
12.00	0.3	60	40

在该流动相梯度下五氯酚于3.97min出峰，目标峰附近有干扰峰，其实际样品图谱见图1。

图1 按GB 23200.92-2016流动相为甲醇+5mmol/L乙酸铵液的鸡肉样品图谱

按2.3优化后的液相色谱条件进样分析，五氯酚于6.55min出峰，目标峰附近没有干扰峰，与基质干扰物实现了基线分离，其鸡肉样品的图谱如图2。

图2 按本文2.3流动相为0.05%甲酸+乙腈的鸡肉样品图谱

3.2 固相萃取小柱的选择和分布收集

在SPE操作过程中，分布收集是一种非常实用的实验技巧，分布收集就是通过收集上样液、淋洗液、洗脱液甚至进行二次洗脱，并上机分析，从而判断目标化合物具体损失的环节，明确实验步骤中具体需要优化的环节。根据以上讲述，按GB 23200.92-2016分别收集上样液、淋洗液、4%甲酸甲醇洗脱液、8%甲酸甲醇洗脱液，进行实验，得出实验数据，见表3。

表3 MAX固相萃取小柱的分布收集回收率

项目	基质加标回收率（%）
MAX小柱基质加标上样-1	0
MAX 小柱基质加标上样-2	0
MAX小柱基质加标淋洗液-1	0
MAX 小柱基质加标淋洗液-2	0
MAX小柱基质加标4%甲酸甲醇洗脱-1	0.00
MAX小柱基质加标4%甲酸甲醇洗脱-2	0.00
MAX小柱基质加标8%甲酸甲醇洗脱-1	80.2
MAX小柱基质加标8%甲酸甲醇洗脱-2	82.4

MAX小柱净化吸附原理：五氯酚属于酸性化合物，其pKa接近5，在酸性条件下呈分子状态, 更易溶于有机溶剂, 在碱性条件下呈离子态, 更易溶于水，GB 23200.92-2016是采用5%三乙胺70%乙腈水溶液提取；该提取液中含有水分, 导致提取液中干扰物较多, 即使低温条件下高速离心后有些样品也有些浑浊。故需净化处理； MAX小柱：碱性条件上样，五氯酚离子化，被小柱吸附；酸性洗脱：五氯酚变回中性分子，失去与小柱间的作用力，被洗脱出来，因此不同品牌的MAX柱对五氯酚的保留能力不同，如果更换了不同品牌的MAX柱须对其做不同酸度的洗脱试验。从表2可以看出：将4%甲酸甲醇洗脱改成8%甲酸甲醇洗脱，可以将五氯酚目标物从MAX柱上洗脱下来，回收率从0提高到80%以上。

3.3溶剂效应和基质效应考查 GB 23200.92-2016标准采用的是空白样品基质匹配来配制工作曲线，本文考察了猪肉、鸡肉、淡水鱼、牛奶、猪肝等动物源性组织样品的基质效应情况, 具文献介绍, 基质效应ME=K1/K2，K1为基质匹配标准曲线斜率，K2为标准溶液曲线斜率，如果ME在（0.8～1.2）范围内时，基质效应不显著；如果ME大于1.2时，五氯酚信号响应在该样品基质为具有显著增强；如果ME小于1.2时，五氯酚信号响应在该样品基质为具有显著减弱；分别以各类不同样品基质阴性样品提取液为基质溶液作溶剂，以相应的基质提取溶液不同浓度为横坐标，其相应的响应信号为为纵坐标，绘制标准曲线。具体结果见表4。

表4 样品基质工作曲线回归方程、相关系数及基质效应ME

序号	样品基质提取液	工作曲线	相关系数	基质效应ME	基质效应
1	纯溶剂（50%甲醇水溶液）	y=3.335e4*x-5.445e3	0.9983	/	/
2	鸡肉基质	y=3.083e4*x+2.086e4	0.9940	3.083e4/3.335e4=0.9	不显著
3	鱼肉基质	y=4.2e4*x+2.415e3	0.9934	4.2e4/3.335e4=1.2	不显著
4	猪肝基质	y=3.0015e4*x-6.954e3	0.9994	3.0015e4/3.335e4=0.9	不显著
5	牛奶	y=5.564e4*x-4.426e4	0.9923	5.564e4/3.335e4=1.7	增强

除牛奶基质外，鸡肉、鱼肉、猪肝基质效应不显著，这也说明了采用Copure(逗点)的 MAX净化小柱有较好的净化效果，可以采用溶剂（50%甲醇水溶液）来绘制工作曲线。

3.4 方法学验证

3.4.1方法的回收率、精密度取阴性空白鸡肉、猪肝样品基质分别做三个浓度水平（1.0ug/kg、2.0ug/kg、4.0ug/kg）加标回收实验，称取样品2.0克加入五氯酚标液（20ng/mL）（100uL、200uL、400uL）），理论上机浓度相应为1.0ng/mL、2.0ng/mL及4.0ng/mL。

样品加标回收率与方法精密度的实验数据（n=6）

序号	样品基质	加标量（ug/kg）	回收率（%）						平均回收率（%）	RSD （%）
序号	样品基质	加标量（ug/kg）	1	2	3	4	5	6	平均回收率（%）	RSD （%）
1	鸡肉	1.0	121.1	132.7	94.8	87	109.7	110.1	109.2	15.3
		2.0	84.3	110.35	109.5	83.9	76.45	99.75	94	15.4
		4.0	54.53	56.58	70.50	71.25	67.80	71.13	65.3	11.8
2	猪肝	1.0	107.9	115.6	124.1	132.4	134.8	112	121.1	9.1
		2.0	132.7	123.9	102.2	106.2	112.4	104.9	113.7	10.7
		4.0	80.5	82.6	94.9	81.0	81.5	86.5	84.5	6.6