气相色谱-串联质谱检测水产品中氯霉素残留量
关键词：氯霉素；气相色谱-串联质谱；残留量；水产品
氯霉素 ( Chloramphenicol，以下简称CAP），是1947年从委内瑞拉链霉菌的培养滤液中分离出的结晶性抗菌素，是第一个采用化学合成法生产的抗生素，具有广谱抗生素的特点，对多种病原菌有较强的抑制作用。在水产养殖业中，常用氯霉素治疗各种传染性疾病， 但同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。研究表明，氯霉素有严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性。因此，氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视，欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零允许量”，即不得检出。
目前常用GC-ECD、HPLC-UV、ELISA、GC-MS等仪器进行氯霉素残留量的检测，本实验采用串联质谱作为检测器，是最为先进的技术，可提高氯霉素定性与定量的准确性，二级质谱相对于一级质谱，其抗干扰能力更强，可有效消除单级质谱的离子信息少的问题，对样品前处理的要求教低，可准确反映样品中氯霉素的残留量。本次实验采用气相色谱-串联质谱法测定鱼肉中氯霉素，其灵敏度、稳定性、准确度均较高。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验对象：鱼肉组织。
1.1.2 主要试剂与材料：乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈（Fisher Scientific公司，色谱纯)；BSTFA（衍生化试剂-Supelco)；C18固相萃取柱（安捷伦公司）；氯霉素标准（SIGMA-ALDRICH）
1.1.3 主要仪器：气相色谱—质谱联用仪（配电子轰击离子源，安捷伦公司）；均质机（IKA）；离心机（天美）；固相萃取装置（Supelco）；分析天平（Mettle-Toledo公司）；旋转蒸发仪（EYELA公司）。氮吹仪；固相萃取装置（Supelco）
1.2 标准溶液配制
氯霉素标准溶液：配制100 mg/L的标准储备液，保存于1~4℃冰箱中冷藏，使用时用甲醇稀释至相应浓度做标准工作曲线。
1.3 样品前处理
1.3.1 分离提取：准确称取鱼肉（鱼糜状）5g±0.01于具塞离心管中，加入20mL乙酸乙酯，在组织匀浆机均质1min，在用15mL乙酸乙酯清洗刀头后倒入离心管中，高速离心机10000r/min离心3min后，将上清液倒入浓缩品中，浓缩近干，用甲醇-水溶液5mL定容，待净化。
1.3.2 固相萃取净化：在固相萃取装置上放置C18萃取柱，依次用甲醇、水活化C18柱后抽干，将1.3.1定容液过柱，用5mL水淋洗柱子，抽干后用甲醇溶剂洗脱，收集洗脱液于10mL试管中氮气吹干。
1.3.3 衍生化：吹干的试管中加入0.5mL的甲苯和0.2mL的BSTFA衍生化试剂，在70℃烘箱中衍生30min，取出后氮气吹干0.5mL正己烷定容上机。
1.3.4 标准曲线及质控样：分别配置,0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L浓度的标准液，按1.3.3衍生化后进样制作标准曲线，同时在1.3.1过程中称取2个样品做添加回收率试验。
1.4 测定方法
1.4.1仪器条件
色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；载气：氦气（99.999%）；恒流模式流速：1.0 mL/min；进样：1.0 μL，不分流；进样口温度：250 ℃；程序升温：80 ℃保持1min，以20 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度270 ℃；Q2碰撞气：氮气；溶剂延迟：3 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。扫描范围：50～450 amu；定量方式：外标法。
1.4.2 样品测定
将衍生化后定容的样品及标准装入带内衬管的进样瓶中，按上述色谱-质谱条件进行分析测定，通过色谱工作站记录保留时间、峰面积及二级质谱离子的丰度比。
2 结果与讨论
2.1 方法的线性范围
通过气相色谱-串联质谱联用仪分析的氯霉素标准的色谱图见图1，以峰面积对应其浓度做标准曲线，结果见表1，由图2可见氯霉素在0.5~10.0mg/L的浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数r大于0.999。
图1 氯霉素的GC-MS/MS色谱图（10.0mg/L）
表1氯霉素的串联质谱检测条件及方法学参数
组分 | 保留时间 （min） | 定量离子对（m/z） (碰撞能量/eV) | 定性离子对（m/z） (碰撞能量/eV) | 线性方程 | 相关系数 r2 | RSD% |
氯霉素 | 11.32 | 255>208(15) | 255>178(10) | y=1923.5x-944.2 | 0.9991 | 2.17 |
图2 氯霉素标准曲线（0.50~10.0mg/L)
2.3 方法回收率、精密度及检出限
对昆仑雪菊样品添加0.5和1.0 mg/Kg两种不同浓度的混合标准，按试验步骤操作，其中对0.5mg/Kg浓度添加5个平行样品，对浓度1.0mg/Kg的添加3个样品进行回收率重复测定。按照3倍信噪比作为检出限，通过计算所得的加标回收率、相对标准偏差(RSD)及检出限见表3。本次试验所选择的样品空白测定均未检出氯霉素残留。
表3 氯霉素的平均回收率、RSD值及检出限（n=3、n=5）
组分 | 回收率/% | RSD /% | 定量检出限/(mg·kg-1) |
氯霉素 | 0.5 mg/kg | 1.0 mg/kg | 0.5 mg/kg | 1.0 mg/kg | 0.02 |
83.1 | 85.7 | 4.18 | 3.31 |
3 结论
本实验建立的气相色谱-串联质谱法测定鱼肉中氯霉素兽药残留量的分析方法，该方法简便、快速、准确度和精密度高、操作简便等特点。
参考文献
应助达人
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