DNA的提取与含量测定

梁不凉

2021/11/02
实验猫

私聊

前处理综合讨论

一、试剂和器材

试剂：生理盐水、10％SDS、氯化钠、95％乙醇、氯仿-异戊醇混合液、DNA标准溶液：用0.01mol/L NaOH配成200μg/mL溶液、二苯胺试剂（现用现配）

器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等

二、DNA的提取

1、溶解：

将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；

2、除杂质：

加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；

3、沉淀：

准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；

4、溶解：

将沉淀物用0.1mol/LNaOH约10毫升溶解。

二、DNA含量测定

1、DNA标准曲线的制定
6支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mL DNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2mL。然后各加入4mL 二苯胺试剂，混匀。于60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、制品的测定
取2支试管，各加0.2，0.8mL待测液，加水至2mL（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4mL 二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。

3、根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量.