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【原创】硝基呋喃类代谢物快速检验方法—UPLC/MS/MS (样品前处理只需90min)

qapril

2007/11/20

前处理综合讨论

硝基呋喃类代谢物快速检验方法
—UPLC/MS/MS
1、范围
本方法规定了动物源性食品中四种硝基呋喃类代谢物残留量的高效液相色谱串联质谱快速测定方法。
2、原理
试样中残留的硝基呋喃代谢物用硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、衍生化、净化后用液相色谱串联质谱法进行检测，外标法定量。
3、试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
3.1.1乙腈：色谱纯。
3.1.2甲醇:色谱纯。
3.1.3 乙酸铵：色谱纯。
3.1.4 甲酸：色谱纯
3.1.5 标准品: 氨基脲（SEM）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-乙内酰脲（AHD）：≧99%。
3.1.6 标准贮备溶液:准确称量各SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD 各10 mg，用甲醇分别定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液。
3.1.7 硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒：(提取剂1 20瓶、提取剂2 20瓶、衍生化试剂2瓶、催化剂2瓶、净化柱20根)
4、仪器和设备
4.1.1 Waters ACQUITY UPLC-Micromass Quattro Premier XE
4.1.2匀浆机。
4.1.3旋转蒸发仪。
4.1.4离心机：4 000 r/min
4.1.5可水浴加热超声波清洗机或恒温摇床。
4.1.6聚四氟乙烯离心管:50 mL，具塞。
4.1.7微孔滤膜:0.25 µm。
5、测定步骤
5.1提取、衍生化、净化
5.1.1提取：准确称取已捣碎的样品10.00 g于50 mL离心管中,先后加入提取剂1及提取剂2(液体20.0 mL) 后，漩涡混合后于40℃振摇或超声30min，于6000 r/min离心5 min；
5.1.2衍生化：取出5.1.1中上清液10mL于50 mL离心管中，加入衍生化试剂0.3mL及催化剂0.3mL后混匀，于40℃振摇或超声60 min，取出冷至室温。
5.1.3净化：将净化柱依次用5mL甲醇、5mL水激活后，加5.1.2中试剂正压或负压以2～3mL/min速度过柱，流净后加10mL蒸馏水洗涤，挤干，弃去流出液，用1mL甲醇以2～3mL/min速度洗脱，接收全部洗脱液，用蒸馏水定容至2mL，过0.25µm滤膜,进样分析。
5.2绘制标准工作曲线
移取SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD混和标准溶液，在10mL提取剂2中添加0.5µg/kg、1µg/kg、2µg/kg、5µg/kg标准工作溶液，按5.1测定步骤处理,样液用高效液相色谱仪-串联质谱仪测定，得出标准工作曲线。
5.3测定
5.3.1液相色谱条件
a) 色谱柱: Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (100mm×1.0mm i.d., 1.7μm)
b) 柱温:35℃
c) 样品温度:22℃
d）流动相：A5mmol/l乙酸胺+0.2%甲酸 B:甲醇；
e)流动相梯度：
Time(min) Flow Rate(mL/min) %A %B Curve
1.00 0.300 90.0 10.0 8
3.50 0.300 20.0 80.0 6
4.00 0.300 10.0 90.0 6
4.30 0.300 10.0 90.0 1
4.50 0.300 90.0 10.0 1
5.3.2 质谱条件
a）离子化模式：正离子API-ES；
b）干燥气流量：8.0L/min;
c) 喷嘴压力:35Pa;
d)萃取锥孔电压:5.00~5.25V
e) 雾化气温度:400~394℃;
f)雾化气流速: 803(L/Hr)
g)反吹气流速:45 L/Hr
h).离子源温度:120～119℃
i) 毛细管电压:2.0～１.97KV
j)衍生化物SIM参数,正离子模式
化合物驻留时间(min) 母离子>子离子锥孔电压(V) 碰撞能量
AMOZ 0.05
0.05 324.30>280.20,
324.30>251.20 21.0
21.0 11.0
14.0
SEM 0.10
0.10 198.2>138.10
198.2>181.10 22.0
22.0 19.0
12.0
AHD 0.05
0.10 238.20>167.30
238.20>138.10 25.0
25.0 17.0
20.0
AOZ 0.05
0.05 225.20>138.10,
225.20>125.10 30.0
30.0 18.0
19.0

5.3.2色谱测定
根据样液中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD的响应值均应在仪器的检测线性范围内。
5.3.3空白实验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。
5.4结果计算
用色谱数据处理机或按式（2）分别计算供试样品中的SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD残留量。
nci×V
ω= 　…… (2)
20m

n—为提取样液上清液体积数；
20—液体提取剂体积数；
ω－样品中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD标准工作溶液的浓度，μg/L；
V－最终定容体积数，mL；
m－供试试料样品重量，g。
6、测定低限、回收率
6.1检测限
本方法SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD的检测限均为0.5μg/kg。
6.2回收率
本方法SEM 、AOZ 、AMOZ 、AHD回收率为:85%～105%

另有四环素类、沙星类前处理方法，前处理时间30min，磺胺类前处理方法，水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的快速测定方法，已申请行标SN/T1768-2006。
有需要的可以试验下，提供样品，请联系010-52029409 13810957048张小姐。

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