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【第十四届原创】Leica 荧光显微镜 Confocal共聚焦成像系统使用指导

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2021/11/30
北京化工大学师生团队

金相显微镜

Leica 荧光显微镜
Confocal共聚焦成像系统使用指导
——李函容学号：2020201169

1. 拍摄样品准配

（1）养细胞：复苏后传代1-2次，细胞活力较高时使用

（2）铺板：细胞消化后用完全培养基稀释至5-10×104个/mL,添加在共聚焦小皿中（每孔2 mL）,37℃ 24小时培养至贴壁

（3）准备荧光标记的样品

（4）细胞摄取：控制细胞密度约60%加药，控制药物浓度，避免对细胞太强的杀伤作用

（5）固定染色：此步骤可以拿出细胞间，在外面操作完成。

? 吸走皿中的培养基；用PBS清洗2次，可以摇床摇动2-3min

? 每皿加入1mL 4%多聚甲醛，注意从边缘添加，不要冲走过多的细胞。室温下固定15min，注意固定时尽量不要移动培养基，避免摇晃影响细胞状态。

? 用PBS清洗3次，直接倒掉即可，不用摇。

? 配置DAPI溶液：1mg/mL 的原液，取10u+990u PBS，配置成10ug/mL的溶液，可以一次多配一些分装。

? 在皿中加入900uL PBS，在皿中央加入100u 10ug/mL DAPI溶液，十字交叉摇晃均匀。避光孵育15min。

? 用PBS清洗2次，加入2滴抗荧光衰减封片剂（主要成分为甘油），避光保存待检测。

（6）检测前，吸走封片剂。

2. 观察皿的选择：

? 共聚焦皿：中间部位是观察部位，玻璃制造，透光性较好，周围塑料。

不建议使用平时的细胞培养皿，原因：板子较厚，透光性不够

皿是否能重复使用：做材料不需要无菌，可以重复使用；细胞成像不可重复使用

? 载破片+盖玻片组合：细胞爬片，用指甲油封边，倒置观察（薄的一边冲下）；材料也可以滴在片子上，记得一定要盖上盖玻片，保证盖玻片洁净，记得封片。

3. 上下机流程：

? 上机：刷卡——听到“用户上机！”——按照“1-6”的顺序依次打开6个开关，其中“6”是个钥匙，竖着表示开机——电脑用第二个用户名进入，软件“LAS X：Leica Application Suite X”

? 下机：先关软件，再关电脑“3”——按照“6-5-4-2-1”顺序依次关闭——清洁用过的镜头——刷卡——听到“用户关机！”

4. 模式选择：

初始界面：

? 选择configuration、machine（最常用共聚焦拍摄模式）、widefield（宽场模式—荧光显微镜-看切片）

? 其他的选项都不要动

? 确认选择后点“OK”，然后能听到一些启动的声音，这个时候尽量不要碰仪器

5. 观察流程：

? 先在显微镜处用肉眼观察，判断材料合成大致情况，②“明场、荧光”常用。

1) 抬起显微镜镜头，放置样品

注意事项：载物台上有个支架，支架必须保证完全嵌入，才能保证载物台是平整的，先把小红点的位置卡进去；放样品要轻缓

2) 与正常流程一致进行对焦

镜头位置调节：先降到底部，再反方向调节，粗调-细调

肉眼观察拍摄范围：

? 明场（BF）状态—点击打开IL-Shutter（目镜观察下的光线）

? 先在10×镜头下观察，选定大范围后选用20×镜头进行局部观察并对焦，对焦清晰后切换至荧光；

? 荧光（FLUO）状态－根据不同观察染料的不同选择不同的FLUO－Filtercubes，DAPI选择DAPI-LP，罗丹明b选择RHOD-LP，聚焦清晰后切换LASX软件

3) 调色板界面设置-（肉眼观察）

（图4：拍摄罗丹明b染液时对应的状态）

4) 载物台调节器

? 使用LAS X软件拍摄

1) 首先打开激光器：顶部configuration菜单-左侧laser configure

2) 单激光拍摄——使用模板

顶部Settings-选择商品化荧光染料-自动匹配通道。材料的吸收峰放在接收波长区间的中间，左右两边拖动多接收一些，扩大接收区域。

使用DAPI染细胞核-有DAPI模板；使用罗丹明b-可以使用倒数第二个模板（cy5的下一个)

注意：激发波长和接受区域之间至少相隔10nm，过于接近可能导致干扰产生。

例如：罗丹明b的激发波长为540nm，则在PM1或PM3处拖动至＞540nm的波长范围进行信号接受

3) 多激光拍摄——染料助手

4) 预览成像效果：

a) 点击选择合适的激光后，点击界面左下角“预览”，在界面右侧的成像区域观察

b) 调节信号强度，显示器下方的一排操作旋钮中的左数第一个，值越高信号越强，一般荧光的是800-1000，最高1100，然后把鼠标移到明场的位置一点，明场的值一般在300左右

c) 操作旋钮最后一个，细调z轴位置，幅度最小，以荧光最强代表聚焦最好的指标

d) 固定Z轴，换激发光，拍摄多个图像，如果某个相的信号特别弱，选中激光控制面板中绿色的那条，用键盘的“↑”一点点调功率，最大不能超过5！

5) 拍摄：调高分辨率，保证清晰度：预览用512*512，拍摄用1024*1024——点“start”——自动序列拍摄

6) 文件生成：左侧菜单栏“open project”生成文件，右边可以“show overlay”，可以选择局部叠加-图像上右键-“snapshot”-最左侧出现保存的叠加了多个成像的文件

7) 文件保存：一定要保存源文件！左侧菜单栏选中文件——save project的一个小磁盘图像点一下——路径“老板的名字-你的名字-日期”例如“yuchangyuan-lihanrong-20200908”，方便查找管理（这个保存的只能用该软件打开）

8) 文件另存为（tiff等）：选中文件-右键-export as-tiff/jpeg/…-找到自己的文件夹-菜单中可以勾选标尺，是否保存“overlay”

9) 设备关闭：关掉软件前先关中间的激光器控制部分，全部点为“off”，再回到“configuration”界面，把激光器也全部关掉，关掉软件，关电脑，擦镜头（用过的都要擦，擦镜纸+乙醇），“6-5-4-2-1”依次关闭。

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