膜脂简介
1.1.1 生物膜-膜脂的角度
在整个生物界，30 ?的疏水膜通常被限定为单个细胞的生死边缘，因而生物膜对生命至关重要[1]。众所周知，生物膜上有各种各样的膜蛋白质和膜脂，各自或协同执行许多与生命活动相关的重要功能。膜蛋白质约占生物体内蛋白质的30%，是目前近60%药物的作用靶点，参与能量代谢、信号转导、运输、免疫应答以及许多酶过程。由于其具有丰度低、溶解性差、稳定性差等特点，膜蛋白质的研究面临着很大的挑战[2-4]。膜脂约占大多数动物细胞膜质量的50%，长期以来被认为只具有结构功能，作为选择性的细胞屏障[5-6]。然而这一功能不足以解释膜脂的普遍性、多样性、复杂性和动态性。膜脂是所有细胞的基本组成成分，在稳定细胞和调节细胞功能方面发挥着重要作用，膜脂的组成随细胞类型的不同而不同且受到严格的调控，可见膜脂具有普遍性和复杂性[7]。不像基因和蛋白质主要是由4种脱氧核糖核苷酸和20种氨基酸通过相同类型的化学键重复连接而成，脂质分子的结构具有多样性和复杂性[8]。如图1-1所示，结构各异的两亲性脂质以磷脂双分子层的形式构建细胞膜，其中甘油磷脂、鞘脂和胆固醇是细胞膜的主要脂质成分[9]。细胞膜中含量最高的甘油磷脂，其结构复杂性体现在，如图1-2所示，甘油sn-3位连接的磷酸基团可被胆碱、乙醇胺、肌醇、丝氨酸或甘油酯化，形成磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酸（PA）；连接至甘油sn-1位和sn-2位的碳氢链在链长、饱和度、双键位置、顺反异构上存在差异；通常碳氢链以酯键与甘油sn-2位连接，以酯键、烷基醚键或烯基醚键与甘油sn-1位连接[10]。鞘脂的多样性则体现在，如图1-2所示，鞘氨醇骨架、含磷酸基团或糖基的极性头部、碳氢链构成的非极性尾部都是可变的且可以产生不同的组合[11]。胆固醇的亲水部分只有一个羟基，剩下的是疏水性的体积庞大的四元甾核和疏水性的短的碳氢侧链，这种结构具有调节细胞膜流动性等重要作用。膜脂的动态性体现在其组成和分布受遗传、饮食、年龄、生活方式、药物、疾病等内源性和外源性因素的强烈影响[12]。
图1-1 细胞膜脂质组成[9]
Fig. 1-1 The lipid composition of cell membranes[9]
图1-2 以甘油磷脂和鞘脂为例说明脂质分子结构多样性和复杂性[11]
Fig. 1-2 The illustration of the diversity and complexity of lipid structures by taking glycerophospholipids and sphingolipids as examples[11]
序列决定结构，结构决定功能，这是生物学的第二个中心信条[13]。基于此，膜脂除了具有结构功能，还作为服务于膜蛋白功能和信号转导的动态基序[14]。就膜蛋白质而言，首先膜脂通过调节细胞膜的整体性能，为膜蛋白质提供合适的膜环境；其次膜脂和膜蛋白质之间具有特定的相互作用，就像水溶性蛋白质周围被一层水分子溶剂化一样，膜蛋白质周围围绕着一层脂质分子，产生类似的溶剂化效应，这层脂质分子称为环状脂质。环状脂质与膜蛋白质之间靠范德华力、静电作用、氢键等作用相结合，但这种结合并不是一成不变的，环状脂质分子与周围脂质分子会按照一定速率进行脂交换，这样一来，膜蛋白质与膜脂之间的作用力随之发生改变，而这些微小的改变，可能对膜蛋白质的功能产生巨大的影响[15]。就膜脂本身而言，它既能直接执行信使分子的功能，又能在细胞内多种酶的作用下，作为脂质第二信使的来源[16]。如磷脂酰肌醇作为信号磷脂，是膜细胞生物学中的中枢调节因子。根据肌醇环的磷酸化程度不同可产生8类磷脂酰肌醇（图1-3），每类磷脂酰肌醇都有自己的定位和分布，参与不同的信号转导途径，发挥不同的生理功能[17-18]。又如在肌肉形成过程中，凋亡的成肌细胞释放的磷脂酰丝氨酸作为信号分子与膜受体-脑特异性血管生成抑制剂1（BAI1）结合，促进成肌细胞融合，形成肌肉[19]。在炎症反应中，经磷脂酶A2催化，细胞膜上的PC能够释放花生四烯酸，作为生物活性脂质介质，负责下游的炎症反应[20]。脂质分子作为信号分子时可以介导特定的受体-配体相互作用，越来越多证据表明单个脂质分子的变化对细胞信号传递的结果起决定作用，另外脂质分子参与多种生化反应，整合不同的代谢途径，因而脂质结构和组成的微小变化会对关键的生物过程产生深远的影响[21-23]。此外，膜脂稳态的改变与免疫性疾病、代谢性疾病、神经系统疾病和癌症等息息相关（图1-4）[24]。
图1-3 磷脂酰肌醇根据磷酸化程度分类
Fig. 1-3 The classification of phosphatidylinositols according to the degree of phosphorylation
图1-4 脂质失衡与人类疾病[24]
Fig. 1-4 Lipid imbalances and human diseases[24]
1.1.2 脂质分析主要挑战
长期以来，细胞膜的研究分为两大阵营，即基于膜蛋白质的研究和基于膜脂的研究[25]。脂质分子易溶于有机溶剂的特性使膜脂在细胞膜研究早期备受青睐。蛋白质是生命活动的主要承担者，1985年，第一个跨膜蛋白质结构问世，膜蛋白质的研究转为细胞膜研究的焦点[26]。膜脂的研究开始处于基因组学、转录组学、蛋白质组学革命的阴影之下，直到2003年，脂质组学一词被正式提出[27-28]，脂质组学在技术进步的驱动下得到了快速发展，其研究范围也不断扩展，脂质作为细胞活性的功能单元的观点重新得到了关注[29]，但由于膜脂种类繁多，结构各异，性质广泛，且处于特殊的环境，对膜脂进行全面检测和准确定量在分析化学领域面临着严峻的挑战。
脂质分析面临的主要挑战有：（1）缺乏更通用的脂质提取方法、更高效的色谱分离技术和更灵敏的质谱平台[30]；（2）缺少交叉实验室验证，没有参考偏差范围的建立，导致不同分析平台和实验室之间的分析数据还存在很大差异[31]；（3）不具备类似于基因组学和蛋白质组学中适用的相当标准化的高通量分析方案[32]；（4）用于色谱/质谱技术进行脂质表征的参考物质或标准物质或可被标记的内标有限[33]。
1.1.3 脂质分析主要策略
基于膜脂组成高度复杂且呈现出较大的极性差异和丰度差异，没有一种通用的提取、色谱分离和检测方法能够涵盖所有的脂质分子种类[34]。典型的脂质组学分析工作流程如图1-5，脂质分析主要有两大策略，即“鸟枪法”和“液相色谱-质谱联用法（LC-MS）”[35]。
图1-5 典型的脂质组学分析流程图[35]
Fig. 1-5 Flowchart of typical lipidomics analysis[35]
“鸟枪法”用于脂质分析时，将脂质提取物直接注入质谱仪，该方法以快速简便，易于实现高通量脂质分析而著称。“鸟枪法”进行脂质分析时，不经过预先色谱分离步骤，所有样品直接进入质谱仪同时被电离，这样脂质提取物中的一些盐、极性代谢物以及残留蛋白质等杂质不仅会对脂质分子的电离产生影响（增强或抑制），还会对质谱仪造成一定损害[36-37]。此外，在“鸟枪法”中还存在交叉脂类干扰，脂质异构体分子分离困难，光谱高度复杂等问题[38]。
LC-MS法可以很好的弥补“鸟枪法”的缺陷。通过色谱分离过程，可以将脂质分子与杂质分离，同时将脂质分子按照类别或种类分离后进入质谱仪，可以减少基质复杂性和离子抑制效应，提高检测的灵敏度和准确性。液相色谱法用于脂质分析的其它优势还包括：色谱分离过程起到一定富集作用；色谱保留时间可作为鉴定手段增加选择性从而降低分析复杂性；色谱系统与环境相对隔离，在室温下运行即可，可以减少脂质分子的氧化和降解[39-40]。另外，液相色谱可采取多种分离模式进行分离分析。反相色谱是脂质分析最常用的分离技术之一，其可根据酰基链的疏水性进行分离，可以实现脂质分子（碳链长度、双键数目、双键位置）结构细节的鉴定，有利于脂质异构体分子的分离检测[41]。常见的脂质分子异构体形式如图1-6所示，包括sn-1/sn-2构造异构体、双键位置异构体、双键顺反异构体和R/S异构体，这些异构体分子往往具有不同的生理功能，它们各自的定性定量分析可能为阐明脂质的生物学作用提供新的见解。
液相色谱的发展，使脂质异构体分子比以往任何时候都得到了更好的分离，高效液相色谱（HPLC）与质谱联用将人们对于脂质在细胞功能中的多重作用的认识带入了一个新的时代[42-44]。
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