1 实验室基本情况
表1-1参加验证的人员情况表
仪器名称 | 仪器型号 | 制造厂商 | 设备编号 | 检定/校准有效期 |
三重四级杆液质联用仪 | TSQQuantis | ThermoFisher | S103 | 2023.8.30 |
电子天平 | AUW220D | 岛津制作所试验计测事部 | S063 | 2023.8.30 |
电子天平 | JE1002 | 上海浦春计量仪器有限公司 | S075 | 2023.8.30 |
恒温震荡水浴摇床 | SHA-B | 金坛仪器 | S148 | / |
旋涡混匀器 | DHM-200 | 宁波洛尚智科技有限公司 | S113 | / |
高速离心机 | TGL-16M | 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 | S114 | / |
氮吹仪 | M64 | 北京莱伯泰科仪器股份有限公司 | S101 | 2024.4.6 |
试剂名称 | 生厂商 | 备注 |
乙腈 | 赛默飞 | 质谱级 |
甲醇 | 赛默飞 | 质谱级 |
甲酸 | 科密欧 | 色谱级 |
高氯酸 | 天津鑫源化工 | 优级纯 |
氨水 | 福晨化工 | 优级纯 |
乙酸乙酯 | 坛墨 | 色谱级 |
叔丁基甲醚 | 科密欧 | 色谱级 |
Β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶 | 源叶生物 | 60u/ml |
标液 | 坛墨 | 100ug/ml |
混合型阳离子交换固湘萃取柱CopureMXC | 逗点科技 | 60mg/3ml |
仪器名称 | 仪器型号 | 制造厂商 | 设备编号 | 检定/校准有效期 |
三重四级杆液质联用仪 | TSQQuantis | ThermoFisher | S103 | 2023.8.30 |
电子天平 | AUW220D | 岛津制作所试验计测事部 | S063 | 2023.8.30 |
电子天平 | JE1002 | 上海浦春计量仪器有限公司 | S075 | 2023.8.30 |
恒温震荡水浴摇床 | SHA-B | 金坛仪器 | S148 | / |
旋涡混匀器 | DHM-200 | 宁波洛尚智科技有限公司 | S113 | / |
高速离心机 | TGL-16M | 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 | S114 | / |
氮吹仪 | M64 | 北京莱伯泰科仪器股份有限公司 | S101 | 2024.4.6 |
试剂名称 | 生厂商 | 备注 |
乙腈 | 赛默飞 | 质谱级 |
甲醇 | 赛默飞 | 质谱级 |
甲酸 | 科密欧 | 色谱级 |
高氯酸 | 天津鑫源化工 | 优级纯 |
氨水 | 福晨化工 | 优级纯 |
乙酸乙酯 | 坛墨 | 色谱级 |
叔丁基甲醚 | 科密欧 | 色谱级 |
Β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶 | 源叶生物 | 60u/ml |
标液 | 坛墨 | 100ug/ml |
混合型阳离子交换固湘萃取柱CopureMXC | 逗点科技 | 60mg/3ml |
2 方法验证过程
2.1酶解与提取：
称取试料2 g(准确至士0. 05 g),于50 mL离心管内，加0. 2 mol/L乙酸铉缓冲溶液6 mL、食葡萄糖 醛酸酶/芳基硫酸酯酶40 μl涡旋混匀，37笆避光水浴振荡16 h,放置至室温,备用。
2.2萃取、净化浓缩
取备用液，加100 ng/mL内标工作液100 /L,涡旋混匀，8 000 r/min离心8 min,取上清液，加 0. 1 mol/L高氯酸溶液5 mL,涡旋混匀，用高氯酸调pH至1.0±0. 2,8 000 r/min离心8 min后,将上清液用 10 mol/L NaOH 溶液调 pH 至 10士0. 5。 加乙酸乙酯15 mL,中速振荡 5 min, 5 000 r/min 离心5 min,取上层有机相。下层水相中再加入叔丁基甲醚10ml，中速震荡15min， 5 000 r/min 离心5 min,取上层有机相上层有机相合并,50 °C下氮气吹干，用2%甲酸溶液5ml溶解，备用。取混合型阳离子交换固相萃取柱，一次用甲醇、2%甲酸溶液个3ml，活化，取备用液过柱，依次用2%甲酸溶液、甲醇各3ml淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3ml洗脱，洗脱液在50℃下氮气吹干。残余物中加入甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）0.5ml，充分溶解，过0.22um微孔滤膜，上机检测。
2.3标准曲线的制备
取混合标准储备液混合内标储备液用，用甲醇0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）稀释配制成0.5,1，2,5,10,20ng/ml上机工作液。
2.4测定
2.4.1液相色谱条件
色谱柱：沃特世 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7um 2.1*100mm
流动相：A：0.1%甲酸溶液 B：0.1%甲酸乙腈
梯度洗脱
时间/min | A% | B% |
0 | 95 | 5 |
0.5 | 95 | 5 |
5 | 40 | 60 |
5.5 | 10 | 90 |
7 | 10 | 90 |
7.5 | 95 | 5 |
8.5 | 95 | 5 |
2.4.2串联质谱条件
a、 离子源ESI
b、 扫描方式 ：正模式
c、 检测方式：MRM
d、 电喷雾电压：3500
e、 Ion Transfer Tube Temp （℃）：325
f、 Vaporizer Temp（℃）：300
g、 Sheath Gas （Arb）：35
h、 Aux Gas (Arb):15
i、 Sweep Gas (Arb):10
离子信息条件
药物 | 定性离子对 m/z | 定量离子对 m/z | 去簇电压V | 碰撞能量 eV |
克仑特罗 | 277. 0>203. 0 | 277. 0>203. 0 | 40 | 21 |
277. 0>168. 1 | 38 | |||
克仑特罗-D9 | 286. 0>204. 0 | 286. 0>204. 0 | 50 | 23 |
莱克多巴胺 | 302. 2>164. 1 | 302. 2>164. 1 | 40 | 23 |
302. 2>107.1 | 51 | |||
莱克多巴胺-D6 | 308.1>168. 1 | 302. 2>168. 1 | 40 | 23 |
沙丁胺醇 | 240. 2>148. 1 | 240. 2>148. 1 | 40 | 24 |
240. 2>222. 1 | 15 | |||
沙丁胺醇-D3 | 243. 1>151.0 | 243. 1>151.0 | 30 | 25 |
西马特罗 | 220. 0>160. 0 | 220. 0>160. 0 | 40 | 22 |
220. 0>202. 0 | ||||
13 | ||||
西马特罗一 D7 | 227. 2>161. 1 | 227. 2>161.1 | 40 | 23 |
氯丙那林 | 214. 0>154. 1 | 214. 0>154.1 | 40 | 23 |
214. 0>118. 0 | ||||
34 | ||||
氯丙那林-D7 | 221. 0>155. 0 | 221.0>155. 0 | 40 | 23 |
特布他林 | 226. 2>152. 0 | 226. 2>152. 0 | 40 | 21 |
226. 2>107.1 | 36 | |||
特布他林-D9 | 235. 2>153.1 | 235. 2>153.1 | 40 | 20 |
3、 处理结果
3.1线性结果
表1线性范围0.5-20ng/ml
名称 | 相关系数 | |
克伦特罗 | 0.9988 |
|
莱克多巴胺 | 0.9991 |
|
沙丁胺醇 | 0.9985 |
|
西马特罗 | 0.9994 |
|
氯丙那林 | 0.9999 |
|
特布他林 | 0.9977 |
|
以上结果表明在线性范围0.5-20ng/ml范围内，线性R2均在995以上，浓度和峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。
3.2检测线、定量限
用阴性猪肉空白基质逐级稀释混标至0.5ng/ml
所得信噪比S/N＞3，得出方法检出限为0.125μg/kg，方法定量限为3倍检出限为0.375μg/kg
满足标准要求的方法检出限为0.2μg/kg，方法定量限0.5μg/kg。
3.3方法精密度（重复性）结果
取一加标样品测定7次
RSD-1
RSD-2
RSD-3
RSD-4
RSD-5
RSD-6
RSD-7
表2
项目/含量μg/kg | RSD-1 | RSD-2 | RSD-3 | RSD-4 | RSD-5 | RSD-6 | RSD-7 | 平均值 | RSD% |
克伦特罗 | 1.25 | 1.18 | 1.21 | 1.19 | 1.13 | 1.31 | 1.13 | 1.20 | 4.05 |
莱克多巴胺 | 1.25 | 1.20 | 1.26 | 1.25 | 1.23 | 1.29 | 1.10 | 1.22 | 3.53 |
沙丁胺醇 | 1.16 | 1.20 | 1.24 | 1.20 | 1.11 | 1.14 | 1.03 | 1.15 | 4.52 |
西马特罗 | 1.23 | 1.24 | 1.33 | 1.20 | 1.24 | 1.25 | 1.22 | 1.24 | 2.10 |
氯丙那林 | 1.25 | 1.21 | 1.29 | 1.13 | 1.22 | 1.23 | 1.06 | 1.20 | 4.94 |
马布特罗 | 1.25 | 1.21 | 1.28 | 1.20 | 1.19 | 1.22 | 1.07 | 1.20 | 3.52 |
所得精密度均小于本方法规定批内相对标准偏差≤20%要求，符合该方法要求。
3.4准确度（加标回收）
与样品同步处理对样品进行加标，加标量在0.5ug/kg，1ug/kg，10ug/kg
表3
序号 | m/g | V/ml | C（ng/ml） | 含量ug/kg | 加标量/ug/kg | 回收率/% | |
样品1号 | 2.04 | 2.0 | 克伦特罗 | ND | ND | / | / |
西马特罗 | ND | ND | / | / | |||
莱克多巴胺 | ND | ND | / | / | |||
沙丁胺醇 | ND | ND | / | / | |||
特布他林 | ND | ND | / | / | |||
氯丙那林 | ND | ND | / | / | |||
样品2号 | 2.05 | 2.0 | 克伦特罗 | ND | ND | / | / |
西马特罗 | ND | ND | / | / | |||
莱克多巴胺 | ND | ND | / | / | |||
沙丁胺醇 | ND | ND | / | / | |||
特布他林 | ND | ND | / | / | |||
氯丙那林 | ND | ND | / | / | |||
加标1号 | 2.09 | 2.0 | 克伦特罗 | 0.479 | 0.458 | 0.478 | 95.8 |
西马特罗 | 0.521 | 0.499 | 0.478 | 104.4 | |||
莱克多巴胺 | 0.498 | 0.477 | 0.478 | 99..8 | |||
沙丁胺醇 | 0.476 | 0.456 | 0.478 | 95.4 | |||
特布他林 | 0.538 | 0.515 | 0.478 | 107.7 | |||
氯丙那林 | 0.481 | 0.460 | 0.478 | 96.2 | |||
加标2号 | 2.07 | 2.0 | 克伦特罗 | 0.923 | 0.892 | 0.966 | 92.3 |
西马特罗 | 0.988 | 0.955 | 0.966 | 98.9 | |||
莱克多巴胺 | 0.920 | 0.889 | 0.966 | 92.0 | |||
沙丁胺醇 | 0.905 | 0.874 | 0.966 | 90.5 | |||
特布他林 | 1.005 | 0.971 | 0.966 | 100.5 | |||
氯丙那林 | 0.910 | 0.879 | 0.966 | 91.0 | |||
加标3号 | 2.03 | 2.0 | 克伦特罗 | 9.254 | 9.117 | 9.852 | 92.5 |
西马特罗 | 10.041 | 9.893 | 9.852 | 100.4 | |||
莱克多巴胺 | 9.486 | 9.346 | 9.852 | 94.9 | |||
沙丁胺醇 | 9.815 | 9.670 | 9.852 | 98.2 | |||
特布他林 | 9.395 | 9.256 | 9.852 | 94.0 | |||
氯丙那林 | 9.674 | 9.531 | 9.852 | 96.7 |
加标1
加标2
加标3
由上表可知在加标1倍定量限0.5ug/kg,2倍定量限1.0ug/kg，10倍定量限10ug/kg，回收率在80%-120%范围，符合标准要求。
4 结论
根据GB31658.22-2022《食品安全国家标准动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》要求依法检测，灵敏度、准确度、精密度符合标准规定要求。
wodehisense
第2楼2023/12/29
应助达人标曲中内标是5ng/ml,按照标准100ng/ml加标100ul，最后定容到0.5ml，内标浓度变成20ng/ml,所以改为25ng/ml加标100ul，这样算下来和标曲保持一致都是5ng/ml
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