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亲和层析纯化蛋白注意事项有哪些?
Ins_bf0c01c3
2023/09/06
私聊
生命科学仪器综合讨论
亲和层析依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上。亲和层析通常是最有效的纯化方法,通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标蛋白,同时去除溶液中的污染物或其他分子,并一步富集或纯化目标分子,使其与其他不能结合配体的分子分离。
除了理论上蛋白能够通过免疫亲和层析纯化之外,亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白,而免疫亲和层析是所有亲和技术中特异性最强的。
下面是关于亲和层析纯化蛋白的注意事项!
一、
Ni
柱进行蛋白纯化时注意点:
(1)
避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:
NH4
,甘氨酸,精氨酸,等等;
(2)
各种缓冲液中不能有强螯合剂,如
EDTA
,
EGTA
,等等;
(3)
各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如
DTT
,防止二价
Ni
被还原;
(4)
不能含离子型的去垢剂,比如
SDS
,防止
Ni
流失;
(5)
在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如
0.1-1mM
的
PMSF
,防止目的蛋白被降解;
(6)
缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达
50%
(
v/v
)
(7)
应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;
(8)
缓冲液里
NaCl
的浓度应在
300mM
到
2M
之间;
(9)
可加入变性剂促溶,盐酸胍(最高可
6M
),尿素(最高可
8M
)
(10)
可加入非离子型去垢剂,如
Triton
,
Tween
,
NP40
等,最高
2%
,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;
二、
gst
柱进行蛋白纯化时注意点
(1)
在细胞裂解时,加入终浓度
1
–
10 mM DTT
可以显著提高
GST
融合蛋白的结合效率, 在
Binding Buffer
和
Elution Buffer
中加入
1
–
10 mM DTT
,可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低
(2)
超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。
(3)
在
pH
值低于
6.5
或高于
8.0
结合效率会降低,使用前需用
pH6.5
~
8.0
的
Buffer
如
PBS
进行平衡;
(4)
增大
Elution Buffer
的
pH
值。
Elution Buffer
的
pH
值调至
pH 8
–
9
可以提高洗脱效率而不需要增加
glutathione
的浓度;
(5)
增加
Elution Buffer
的离子强度。加入
0.1
–
0.2 M NaCl
能提高洗脱效率;
(6)Elution Buffer
中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍
GST
融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入
0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside
可以显著增加洗脱效率
三、
proteinA
柱进行蛋白纯化时注意点
(1)
介质的选择
A,G or
其他,其结合能力的选择
(2)
上样流速尽量小,让
Protein G
和抗体有充分的结合时间
(3)
在低
pH
值洗脱后,快速中和。
(4)
长时间保存加入
0.02-0.05
%叠氮钠;
(5)
加入
10%
甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。
(6)
抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。
四、亲和层析配体和洗脱条件
更多详情
亲和层析纯化蛋白
参看:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac
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