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ELISA实验类型及原理详解
Ins_bf0c01c3
2023/09/11
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生命科学仪器综合讨论
ELISA
酶联免疫吸附实验是将已知的抗原或抗体结合在固相载体表面,然后利用酶标记(偶联)的抗体或抗原与之孵育,在通过显色物显色,其显色深浅与待测物质的含量成正比,用肉眼即可观察。在
ELISA
实验中,有三种必需的试剂:已知的抗原或抗体(用于结合到固相载体上);酶标的抗体或抗原(标记物);显色剂(用于显色)。
常见的
ELISA
实验有四种:直接
ELISA
、间接
ELISA
、夹心
ELISA
和竞争
ELISA
。
①直接
ELISA (Direct ELISA)
直接
ELISA
法是将抗原固定于
ELISA
板上,然后用酶标抗体直检测抗原。
相较于其它类型的
ELISA
实验,直接
ELISA
实验步骤少,检测速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反应,测定结果不容易出错。但是由于直接
ELISA
的抗原不是特异性固定的,样本中的所有蛋白质(靶蛋白及其他杂质蛋白)都会与
ELISA
板结合,实验背景会比较高。而且直接
ELISA
每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗,实验不太灵活。另外由于没有使用二抗,信号没有被放大,降低了测定的灵敏度。
对抗原的免疫反应进行分析,通常会使用直接
ELISA
。
优点
:
步骤少,实验周期更短
较低的交叉反应,实验不容易出错
最佳用途:分析抗原的免疫反应
缺点:
背景高
灵活性差,需要针对每种靶蛋白的特异性一抗
检测灵敏度不够高:没有使用二抗,信号没有放大
②间接
ELISA (Indirect ELISA)
间接
ELISA
法是先将抗原结合到
ELISA
板上,随后分两步进行检测:首先加入检测抗体与抗原特异性结合,随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
与直接
ELISA
相比,间接
ELISA
用到酶标二抗,具有更高的灵敏度,也需要更少的标记抗体,更经济。间接
ELISA
还提供了更大的灵活性,因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接
ELISA
实验的缺点是存在交叉反应的可能性(酶标二抗直接与抗原结合),可能会增加背景,同时与直接
ELISA
相比,间接
ELISA
实验多了二抗孵育的步骤,实验周期增长。
间接
ELISA
法适合测定样品中总抗体的浓度。
优点
:
高灵敏度
更经济
更灵活
最佳用途:测定样品中总抗体的浓度
缺点:
可能存在交叉反应
比直接
ELISA
法实验周期长
③夹心
ELISA (Sandwich ELISA)
夹心
ELISA
实验需要用到配对抗体(捕获抗体和检测抗体),其实验原理是将捕获抗体结合到
ELISA
板上,通过捕获抗体固定抗原,随后通过直接
ELISA
或间接
ELISA
的方式进行检测,实验流程如下图所示。在夹心
ELISA
实验中,最重要的是对配对抗体进行验证,确保配对抗体能同时与抗原结合,以确保实验的顺利进行。
夹心
ELISA
实验先将捕获抗体固定于
ELISA
板孔中,然后加入分析物或样品,接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体,则可称为直接夹心
ELISA
;如果检测抗体不带有标记,则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合,这种称为间接夹心
ELISA
。夹心
ELISA
的灵敏度高,它比直接或间接
ELISA
敏感
2-5
倍;同时夹心
ELISA
使用两种特异性抗体与抗原结合,拥有很高的特异性。另外夹心
ELISA
能够通过直接或间接的方式进行检测,有着不错的灵活性。夹心
ELISA
的缺点是对配对抗体要求很高,如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体,则需要进行配对抗体定制并进行优化,因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。
夹心
ELISA
尤其适用于复杂样品的分析,因为抗原不经纯化仍具能有高灵敏度和特异性(例如测量免疫应答中的细胞因子水平)。
优点
:
灵敏度高
特异性好
更灵活
最佳用途:对复杂样品进行分析
缺点:
对于配对抗体的要求高(了解更多配对抗体)
④竞争
ELISA (Competition ELISA)
竞争
ELISA
也成为阻断
ELISA
,是所有
ELISA
实验中最复杂的,但是以上介绍的三种
ELISA
类型都适用于竞争
ELISA
的形式。竞争
ELISA
主要用于通过检测对预期信号输出去测量样品中抗原或抗体的浓度:
在竞争
ELISA
实验中,样品中的抗原或抗体竞争性的结合特定数量的酶标抗体或抗原。样品中抗原浓度越高,输出信号越弱,信号输出与样品中抗原的量成反比。
优点
:
无需样品处理,可检测原油或不纯的样品
重复性好:重复样品和分析之间的差异更小
灵活性高:可基于直接、间接或夹心
ELISA
更稳健:对样品稀释和样品基质效应的敏感性低于夹心
ELISA
最佳用途:常用于只有一种抗体可用于目标抗原的情况,也适用于检测不能被两种不同抗体结合的小抗原
缺点:操作繁琐
义翘神州提供
酶联免疫吸附测定
(ELISA)/
酶联免疫斑点
(ELISpot)
检测服务
,详情可以关注:
https://cn.sinobiological.com/services/elisa-service
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