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杂交瘤技术制备单克隆抗体:详细流程与常见问题解析
Ins_bf0c01c3
2023/10/13
私聊
生命科学仪器综合讨论
杂交瘤技术
是一种将
B
淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合,产生永生化杂交瘤细胞系,然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆,并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为
:抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。(详细实验流程:杂交瘤单克隆抗体制备
SOP
)在单克隆抗体制备过程中,常常会遇到细胞污染,细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题,本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。
一、微生物污染
①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子,如果操作不当,或者是未能及时到位的消杀,就有可能会引入污染。除此之外,还须注意平时使用的一些消毒剂,比如
84
消毒液或者
75%
酒精,要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位,是非常不容易发现的。
②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的
SP2/0
细胞圆润透亮,当被支原体污染后,短期内细胞没有明显的变化,当污染严重后,细胞生长会变得极为缓慢,生长周期变长,细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂,或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔,待产生实体瘤后或产生腹水后,无菌分离重新获得杂交瘤细胞。
③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫,污染后会陆续出现多少不等的小黑点。
二、融合后细胞不生长
①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性,部分毒性试剂作用时间过长引起的。如
PEG
在
10%~60%
都可以进行融合,但浓度越高毒性越大。
②也有可能是使用血清质量比较差,推荐使用胎牛血清。
③还有可能是因为添加的
HAT
试剂中氨基喋呤(
A
)含量过高或
HT
(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)含量过低。
三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体
1
、杂交瘤细胞不分泌抗体,可能的原因有以下几种:
a.
抗原免疫原性弱,免疫效果不好,可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估;
b.
操作过程中脾细胞损伤较多,抗原特异性淋巴母细胞大量死亡;
2
、杂交瘤细胞前期有抗体分泌,后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体,可能的原因有以下几种:
a.HAT
试剂中氨基喋呤(
A
)失效,骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长;
b.
未及时克隆,不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间;
c.
骨髓瘤细胞返祖化,抵抗氨基喋呤(
A
)的选择;
d.
梁色体丢失(突变)
;
e.
支原体污染。
解决方法有三种:第一,及时进行细胞建库;第二,高频次检查细胞状态和是否污染;第三,定期进行抗原筛选。
四、杂交瘤细胞难以克隆化
一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞,就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体,反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化,可以尝试以下解决方法:
①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选,确定最佳批次的血清和使用浓度;
②融合后第一次克隆(一亚)仍需采用含
HT
的条件培养;
③在培养体系中加入白细胞介素
6
(
IL6
),一般商品化的杂交瘤因子都含有
IL6
。
义翘神州提供杂交瘤测序服务和杂交瘤细胞培养及抗体生产服务,具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看
杂交瘤技术:
https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology
杂交瘤细胞培养及抗体生产服务:
https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service
杂交瘤测序服务
:
https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service
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