六、纯化方法 领袖说过:不管黑猫白猫,抓到老鼠就是好猫。对纯化来讲,能拿到纯度好的蛋白,符合你纯化的要求就是硬道理。纯化方法不好讲,各种蛋白不一样,纯化工艺自然不同;即使相同的原料也有不同的纯化方案。纯化的方法我们有层析、沉淀、萃取、透析、超滤等等。 柱层析是纯化最强有力的手段,几乎每种蛋白的纯化都会用到层析。各种层析方法:如亲和、离子交换、疏水、反相、分子筛等等都是我们工艺宝库里的吃饭家伙。不知道怎么吃啊,没办法了,你还是先去补一补基础知识吧。GE公司的一套书个人认为是最佳的入门资料,如Recombinant Protein Purification,Affinity Chromatography,Ion-Exchange chromatography,Gel Filtration,等等,在GE的网站上应该能下载到,或者干脆打个电话给GE的销售员或技术支持,请他给你一个光盘就什么都有了。 在做纯化之前,我们需要知道一些待纯化蛋白的信息。如蛋白质序列,载体类型,理论等电点,理论分子量,疏水性等等,这些都是computer paper work,电脑上查查就有了。如果还能查到一些与目标蛋白纯化相关的文献也不错,不过没有也没关系。我是较少查文献的,奉行的原则是:与其看不如自己做,看了也难以做出来,做不出来了再去看。我就是一个工匠,操作工,而不是做科学的哦。这也是我对纯化的看法,好听一点的就是实践的科学,哈哈。 查文献的目的不在于copy它的纯化工艺,这是新手最最常犯的毛病,以为copy文献就能完成纯化工艺了。要知道文献的真实性是有一点折扣的,作者的原料和纯化的目的与你也不相同。查文献的主要目的在于了解你要纯化的蛋白的性质,它的一些检测方法,特别是有关于活性的检测方法。 怎么讲这一节呢?各种纯化的原理我就不讲了,也不可能有瑞典老兄书上讲得好(GE层析的根在瑞典的uppsala),还是举例来说明吧,做一些简单的分析。讲两个实例,一个是可溶表达的蛋白,一个是不可溶表达的蛋白。
(一)、可溶表达的蛋白A
1、computer paper work: 大肠杆菌BL21,pET32a载体融合表达,N端融合Trx(硫氧还蛋白109aa)和his6-tag(共49aa),DDDDK肠激酶位点后为需要的目标蛋白A,融合蛋白的分子量为21.2kd,Trx(DDDDK前)的分子量为17.1kd,蛋白A的分子量为4.1kd,蛋白A稳定性好,水溶性好,融合蛋白的理论等电点为5.9,Trx(DDDDK前158aa)的理论等电点为5.4,蛋白A的理论等电点为9.7。