全自动固相萃取测定罗非鱼中的氯霉素

疯狂的小金鱼

2023/10/28

私聊

液质联用（LCMS）

全自动固相萃取测定罗非鱼中的氯霉素

前言

氯霉素可作用于细菌核糖核蛋白体的50S亚基，而阻挠蛋白质的合成，属于抑菌性广谱抗生素，能够用于人体某些疾病的治疗，以及作为兽药用于防范及治疗动物疾病。在日常生活中氯霉素等激素类药物会广泛应用于养殖业，例如鱼、虾等水产类食品，养殖户为了所养殖的鱼、虾能够快速生长，并且不生病，会放很多抗生素类药物到养殖的水中，从而造成药物在动物体内及动物体表富集，而人类食用这些肉类会使兽药残留进入人体，从而影响身体健康。

关键词
SPE1000；MiniLab3000；M64；GB31658.2-2021；氯霉素；动物性食品

1. 仪器设备及试剂耗材
1.1 仪器设备
1.1.1 SPE1000全自动固相萃取系统，莱伯泰科公司；
1.1.2 SCIEX-4500 液相色谱-质谱仪，AB公司；
1.1.3 MinLab3000全自动液体处理平台，莱伯泰科公司；
1.1.4 M64高通量平行浓缩仪，莱伯泰科公司；
1.1.5 离心机；
1.1.6 震荡仪。
1.2 试剂耗材
1.2.1甲醇（色谱纯， Fisher Chemical）；
1.2.2乙腈（色谱纯， Fisher Chemical）；
1.2.3正己烷（色谱纯， Fisher Chemical）；
1.2.4乙酸乙酯（色谱纯， Fisher Chemical）；
1.2.5氯化钠（分析纯）；
1.2.6 4%氯化钠溶液：取4g氯化钠（2.5）用水溶解并稀释至100mL，临用现配；
1.2.7 水饱和乙酸乙酯：取400mL乙酸乙酯（2.4）于500mL棕色试剂瓶中，加水50mL，加盖、振摇、静置，使用时取上层溶液；
1.2.8 C18固相萃取柱：1000mg/6mL（莱伯泰科）。
1.3 标准溶液
1.3.1内标储备液：ρ=100μg/mL，氘代氯霉素，国家标准物质；
1.3.2氯霉素储备液：ρ=100μg/mL，国家标准物质；
1.3.3 内标工作液：精密量取内标储备液适量，用流动相稀释成浓度为100ng/mL的内标工作液。4℃保存，有效期6个月。
1.3.4 氯霉素标准工作液：精密量取氯霉素标准储备液适量，用流动相稀释成浓度为100ng/mL的标准工作液。4℃保存，有效期6个月。
2. 实验过程
2.1 提取
取鱼肉5g，加内标溶液50μL、氯霉素标准溶液50μL、乙腈5mL、4%氯化钠溶液5mL，涡旋振荡2min，4000r/min离心10min，取上清液，残渣重复提取1次，合并上清液。加正己烷5mL,涡旋振荡1min，2000r/min离心10min，弃去上层液，正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5mL,涡旋振荡1min，2000r/min离心10min，上层液转移到20mL上样瓶中，重复提取1次，合并提取液，氮气吹干，加水-乙腈（95+5）3mL使溶解，备用。
2.2 净化
将前述制备液按照图1的方法进行萃取净化，收集洗脱液，加水饱和乙酸乙酯4mL，涡旋振荡1min，2000r/min离心5min，取上层液，重复处理1次，合并上层溶液，氮气吹至近干干。加甲醇+水（50+50）1mL溶解，微孔滤膜过滤，供LC-MS/MS测定。

图1 固相萃取方法

2.3 校准曲线配制
按照图2和图3的方法，用全自动液体处理平台配制氯霉素标准曲线，供液质分析。

图2校准曲线配置

图3校准曲线配置

2.4 仪器条件
离子源：ESI 源；离子源温度：120℃；电离电压：2.8KV；
碰撞气：氩气3*10^-3mbar；脱溶剂气速：500L/h；锥孔气速：20 L/h；
色谱柱：C₁₈ (150mm*3.2mm,5μm)；进样量：10μL；柱箱温度：40℃。
表1 流动相梯度表
步骤
总时间
流速（mL/min）
A（水）%
B（甲醇）%
1
0
0.2
100
0
2
1
0.2
30
70
3
2
0.2
20
80
4
4
0.2
20
80
5
5
0.2
100
0
3. 实验结果
3.1 标准样品色谱图
图4氯霉素标样色谱图
3.2 标准曲线图
图5氯霉素标准曲线图
3.3 精密度及准确度结果

经过鱼肉样品提取、净化、浓缩等前处理步骤，得到氯霉素样品加标回收率为86.3%~105.2%，RSD为8.1%，满足GB31658.2-2021中的相应要求。

表2 样品加标回收率

化合物
加标
浓度
μg/kg
加标回收率%
均值
%
RSD
%
1
2
3
4
5
6
氯霉素
1
86.3
84.7
101.3
100.9
93.5
105.2
95.3
8.1
4. 结果与讨论
实验使用全自动液体处理平台配制氯霉素标准溶液，搭配全自动固相萃取净化，能够节约时间，减少人力，真正做到节约成本，提高效率。全自动固相萃取液相色谱串联质谱法能够用于测定罗非鱼中的氯霉素。
参考标准：GB31658.2-2021 食品安全国家标准动物性食品中氯霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

分
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步骤	总时间	流速（mL/min）	A（水）%	B（甲醇）%
1	0	0.2	100	0
2	1	0.2	30	70
3	2	0.2	20	80
4	4	0.2	20	80
5	5	0.2	100	0