利用MGI平台对大豆进行全基因组重测序分析
摘要：本研究建立了MGI平台全基因重测序的方法。MGI平台对大豆的全基因进行重测序结果显示，测序数据质量良好，且与参考基因组比对率较高，符合后续分析要求，对其进行SNP和Indel的变异检测和注释，此结果说明今后可利用MGI平台对其它样品进行全基因重测序分析。
关键词：MGI平台；全基因重测序
Whole genome resequencing analysis of soybeans using the MGI platform
Abstract: In this study, a method for whole gene resequencing on the MGI platform was established. The results of resequencing the whole genes of soybean by MGI platform showed that the sequencing data was of good quality and had a high comparison rate with the reference genome, which met the requirements of subsequent analysis, and the variation detection and annotation of SNP and Indel were carried out, which indicated that the MGI platform could be used to perform whole gene resequencing analysis on other samples in the future.
Keywords: MGI platform; Whole gene resequencing
1 研究背景
大豆是重要的粮食作物和油料作物，也是人类最主要的植物蛋白来源[1]。我国是野生大豆的发源地，有着极其丰富的大豆种质资源基础，但是育种和产量较其他大豆主产国显得略有不足，究其原因是我国对大豆的研究和发掘力度存在不足，因此，对大豆育成品种的改良势在必行。自2010年起，大豆群体水平的重测序也全面开展，在大豆的全基因组变异图谱上也得到了一定的研究进展[2]。本研究利用MGI平台对大豆全基因组进行重测序分析，挖掘全基因组水平上的突变。
2 实验仪器
主要实验仪器：MGISP-960、MGIDL-T7、DNBSEQ-T7
3 实验结果
3.1 测序数据质量
根据MGI平台的测序特点，使用双端测序的数据，要求Q30平均比例在85%以上，可以看出大豆重测序数据Q30平均比例在94.72%以上，说明大豆测序数据质量良好，满足分析要求。
表1 测序数据统计表
Samples | ID | Clean reads | Clean bases | GC Content | %≥Q20 | %≥Q30 |
P117 | P117 | 169494922 | 25424238300 | 36.18% | 98.49% | 95.27% |
P118 | P118 | 166483906 | 24972585900 | 36.47% | 98.61% | 95.70% |
P119 | P119 | 186127112 | 27919066800 | 35.89% | 98.57% | 95.61% |
P120 | P120 | 192397276 | 28859591400 | 36.46% | 98.22% | 94.72% |
P198 | P198 | 141636468 | 21245470200 | 37.11% | 98.67% | 95.84% |
P199 | P199 | 169468714 | 25420307100 | 36.55% | 98.60% | 95.66% |
P200 | P200 | 155078286 | 23261742900 | 37.90% | 98.77% | 96.14% |
样品原始数据碱基质量值可由图1看出不存在异常碱基，6个大豆碱基测序错误率分布均如图1。
图 1 碱基测序错误率分布图
碱基类型分布检查可用于检测有无AT、GC分离现象，若有碱基分离现象可能是测序或建库所带来的，并会影响后续分析。高通量所测序为基因组随即打断后的DNA片段，由于位点在基因组上的分布是近似均匀的，同时，G/C、A/T含量也是近似均匀的。因此，根据大数定理，在每个测序循环上，GC、AT含量应当分别相等，且等于基因组的GC、AT含量。同样因为重叠等的关系会导致样品前几个碱基AT、GC不等波动较大，高于其他测序区段，而其它区段的GC、AT含量相等，且分布均匀无分离现象，如图2所示。
图2 ATGC含量分布图
3.2 与参考基因组的序列比对
3.2.1 比对结果
将测序得到的大豆样品与参考基因进行序列比对，bwa软件主要用于二代高通量测序得到的短序列与参考基因组进行比对，比对结果见表2，根据比对结果可评估测序数据是否满足后续分析。
表2 比对效率统计表
Sample_ID | Mapped(%) | Properly_mapped(%) | Averge_depth |
P117 | 99.99% | 98.53% | 25.44 |
P118 | 99.99% | 98.55% | 24.9 |
P119 | 99.99% | 98.63% | 27.75 |
P120 | 99.98% | 98.28% | 28.58 |
P198 | 99.99% | 98.58% | 21.26 |
P199 | 99.98% | 98.50% | 25 |
P200 | 99.99% | 98.13% | 23.13 |
将比对到不同染色体的Reads进行位置分布统计，绘制Mapped Reads在参考基因组上的覆盖深度分布图，见图3。
图3 Mapped Reads在参考基因组上的位置及覆盖深度分布图
统计Mapped Reads在指定的参考基因组不同区域的数目，绘制基因组不同区域样品Mapped Reads的分布图，见图4
图4 基因组不同区域Reads分布图
3.2.2 插入片段长度检验
通过检测双端序列在参考基因组上的起止位置，可以得到样品DNA打断后得到的测序片段的实际大小，即插入片段大小（Insert Size），它是信息分析时的一个重要参数。插入片段大小的分布一般符合正态分布，且只有一个单峰，Insert Size分布图可以展示各个样品的插入片段的长度分布情况。各样品的插入片段长度模拟分布图见图5。
图5 插入片段长度模拟图
3.2.3深度分布统计图
Reads定位到参考基因组后，可以统计参考基因组上碱基的覆盖情况。参考基因组上被reads覆盖到的碱基数占基因组的百分比称为基因组覆盖度；碱基上覆盖的reads数为覆盖深度。基因组覆盖度可以反映参考基因组上变异检测的完整性，覆盖到的区域越多，可以检测到的变异位点也越多。
覆盖度主要受测序深度以及样品与参考基因组亲缘关系远近的影响。基因组的覆盖深度会影响变异检测的准确性，在覆盖深度较高的区域（非重复序列区），变异检测的准确性也越高。
另外，若基因组上碱基的覆盖深度分布较均匀，也说明测序随机性较好。样品的碱基覆盖深度分布曲线和覆盖度分布曲线见图6。
图 6 深度分布统计图
3.3 变异检测
3.3.1 SNP检测与注释
根据变异位点在参考基因组上的位置以及参考基因组上的基因位置信息，可以得到变异位点在基因组发生的区域（基因间区、基因区或CDS区等），以及变异产生的影响（同义非同义突变等）。软件可以使用vcf格式文件作为输入和输出，见图7和图8。
图7 SNP突变类型分布图
图8 SNP注释分类图
3.3.2 Indel检测与注释
根据所有样品在CDS区和全基因范围的Indel长度进行统计，其长度分布如图9。
图9 全基因和编码区Indel长度分布图
根据样品检测得到的Indel位点在参考基因组上的位置信息，对比参考基因组的基因、CDS位置等信息，可以注释Indel位点是否发生在基因间区、基因区或CDS区、是否为移码突变等。发生移码突变的Indel可能会导致基因功能的改变，具体注释结果见图10。
图 10 Indel 注释分类图
4 结论
本文基于MGI对大豆进行重基因测序，实验结果可看出，大豆样品测序产出数据良好，与参考基因组序列比对率较高，符合后续分析，对其进行变异检测可得到SNP和Indel的结果。其它研究表明MGISEQ-2000全基因组重测序表现性能稳定、质量可靠，在实际应用上有明显的优势和应用价值[3]。对本次实验说明MGI平台对样品进行重测序效果良好，后续可对其它植物进行重测序。
参考文献：
[1] 张永芳,钱肖娜,王润梅,等. 不同大豆材料的抗旱性鉴定及耐旱品种筛选[J].作物杂志,2019(5): 41-45.
[2] 邬启帆. 基于基因组重测序黄淮海大豆育成品种遗传结构及重要家族遗传基础研究[D]. 南昌大学, 2023.
[3] 李伟宁,刘刚,周荣等. MGISEQ-2000、HiSeq 2000与NovaSeq 6000平台全基因组重测序数据的比较分析[J]. 中国畜牧杂志,2021,57(11):156-162.
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