富集O-GlcNAc糖肽新平台研究基础
在基于化学酶促反应-可逆羟胺富集O-GlcNAc糖肽的方法开发方面，已经初步建立了新的一步法标记富集O-GlcNAc糖肽新平台，具体阐述如下：
基于化学酶促反应标记-可逆羟胺富集的原理，设计了整体实验流程，将简单或复杂的样本进行提蛋白、酶解、切糖、转糖等前处理步骤，用羟胺材料进行可逆富集，将洗脱样品进行质谱检测分析。（图一）
图1. 转接Gal-ketone羟胺材料富集O-GlcNAc糖肽实验流程
在羟胺材料制备及表征方面，与郭志谋老师合作，在硅胶材料上键和上烯丙基羟胺小分子，合成羟胺材料，巯基硅胶碳含量为5.32%，氮含量为0.1%，SOA填料碳含量为6.33%，氮含量为0.41%。表结果为5um硅胶的比表面积为337m2/g，键和密度为0.85umol/m2。（图2）
图2. 羟胺材料的制备与表征
在标肽层次进行UDP-糖的筛选、转糖、富集、释放可行性的考察，本研究通过合成更高效的UDP-糖，提高转糖效率。（图3）我们分别选用了文献中报道过的UDP-GalNAz, UDP-GalNAc以及本研究中的UDP-GalNAc在标肽中进行转糖活性验证。并对合成的UDP-糖对O-GlcNAc转接Gal-ketone反应条件进行了优化，目前30℃条件下5-6小时即可达到很高的反应效率，一般转接Gal或者GalNAc实验需要4℃条件下反应20小时，相比之下转糖时间大幅缩短，大大提高了转糖效率。使用烯丙基羟胺材料对转糖标肽（P2：NNLEES*(O-GlcNAc)LLKLE）进行富集，在只有转糖标肽和未转糖标肽存在的情况下，富集反应4小时即可反应完全。释放条件优化方面，目前500mM甲氧羟胺/50mM醋酸钠/1%苯胺可以达到很好的释放效果。
图3. 标肽层次对方法可行性的验证
对标肽层次转化效率以及选择性进行分析，测试了三条带有O-GlcNAc修饰的肽段（SGP1：NNLEES(GlcNAc)LLKLE；SGP2：SVES(GlcNAc)GSVDVK；SGP3：TAPTS(GlcNAc)TIAPG）转接酮糖后与烯丙基羟胺、甲氧羟胺的反应活性。同时运用BSA干扰实验在标肽层次对结果表明在糖肽：BSA=1:1000的条件下也可以将糖肽很好的富集出来，并且特异性较高。（图4）
图4. 标肽层次对转化效率及特异性考察
进而使用HeLa细胞核肽进行转糖富集实验条件优化，用Tip洗涤材料并在一定程度上减少材料用量可以降低非特异性吸附，目前实验结果在pH=5.0条件下，400微克肽段对应2mg富集材料的效果最好，使用这个条件对HeLa细胞全肽进行富集，400微克HeLa细胞全肽可富集到1080个O-GlcNAc肽段，氨基酸顺序大于3的844处潜在修饰位点中只有31处位于NXS/T序列，与天冬酰胺在蛋白质中的频率基本相符，提示本方法不引入此类假阳性干扰。对鉴定到的O-GlcNAc修饰糖肽进行GO分析，对蛋白参与的生物学过程、细胞定位及分子功能进行研究。（图5）
图5. Hela细胞全肽O-GlcNAc糖基化水平及GO分析
以上工作在简单标肽样品及复杂样品：Hela细胞核肽及细胞全肽样品层次均证实了方法的可行性，实现了对O-GlcNAc糖肽的一步标记，一步富集，通过优化转糖、富集步骤，大大提高了O-GlcNAc糖肽的鉴定数量，为该方法应用于后续对O-GlcNAc水平调控相分离的研究提供了可靠的技术支持。
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