金黄仓鼠胚胎工程实验室的建设与应用
曾文滔
（南京医科大学医药实验动物中心，江苏 南京 211166）
摘要：基因修饰金黄仓鼠在生命科学研究中具有广泛的应用前景，但其早期配子及胚胎对光照、温度异常敏感，导致基因编辑等相关生殖实验效率低下。案例通过优化实验室仪器布局、减少外环境过度时间、改造实验室光源及仪器光源减少胚胎光毒性等举措，克服金黄仓鼠早期胚胎体外操作的各项技术难关，实现单一培养液将金黄仓鼠受精卵培养至囊胚期，并完成多种类金黄仓鼠早期胚胎体外验证与应用实验，建立了以基因编辑技术体系为核心的金黄仓鼠胚胎工程实验技术体系。该实验设施及仪器光源改造简单，易于在金黄仓鼠基因编辑与胚胎工程相关研究应用中推广。
关键词：金黄仓鼠；胚胎；基因编辑；红光
中图分类号：Q95-33 文献标识码：A
Construction and Application of Golden Hamster Embryo Engineering Laboratory
WenTao Zeng
(Animal Core Facility of Nanjing Medical University, Nanjing 211166, China)
Abstract: Genetically modified golden hamsters have broad application prospects in life science research, but their early gametes and embryos are abnormally sensitive to light and temperature, leading to low efficiency in reproductive experiments such as gene editing. This case study overcame various technical difficulties in the in vitro operation of early golden hamster embryos by optimizing the layout of laboratory instruments, reducing excessive time in the external environment, modifying laboratory light sources and instrument light sources to reduce embryo phototoxicity, and achieved the cultivation of golden hamster fertilized eggs to the blastocyst stage with a single culture medium. Multiple types of early golden hamster embryos were validated and applied in vitro, and a golden hamster embryo engineering experimental technology system centered on gene editing technology was established. The experimental facilities and instrument light source modification are simple and easy to promote in research applications related to gene editing and embryo engineering of golden hamsters.
Keywords: Golden hamsters ; Embryo; Gene editing; Red light
1 实验室建设背景和应用价值
1.1 建设背景
实验动物在科学研究中应用广泛，被称为“活的精密仪器”，包括“科技创新 2030-重大项目”“国家重点研发计划”等国家专项研究计划，均有涉及实验动物及动物模型的研发任务[1]。随着模式动物领域的快速发展，越来越多的研究显示小鼠基因功能的研究结果并不能完全代表人和哺乳动物[2-3]，在脂代谢心血管疾病、生殖发育、传染病等研究领域，金黄仓鼠有望部分取代小鼠，成为人类疾病研究的重要模式动物[4]。因此，完善和建立精准反应人类特定疾病发生机制的新型基因修饰动物，符合国家基础研究与科技创新的战略要求，契合生命科学研究对实验动物的多元化需求。
1.2 应用价值
基因工程模式动物构建及应用涉及众多生殖实验技术体系，包括种资源冷冻保存与复苏、体外受精、胚胎显微注射、胚胎冷冻复苏、病原微生物生物净化等，任何技术体系的缺失都会严重限制该物种在现代生命科学中的应用深度。本案例通过优化实验室仪器布局、改造实验室光源及仪器光源等举措，成功攻克金黄仓鼠早期胚胎体外操作技术难关，实现单一培养液将金黄仓鼠受精卵培养至囊胚期，并高效支持金黄仓鼠早期胚胎多种类生殖实验，满足金黄仓鼠基因修饰模型开发与研究的整体技术需要。
2 技术难点与创新点
2.1 难点
自 2013 年 CRISPR/Cas9 技术问世以来，尽管已有少数实验室成功报道了基因编辑金黄仓鼠相关的研究工作，但金黄仓鼠胚胎对光照、pH 值和温度变化等条件非常敏感，极易形成二细胞期发育阻滞[2-5]，金黄仓鼠在基因编辑及种资源冷冻保存等技术领域，与小鼠相比还存在着巨大差距。在众多敏感因素中，光毒性一直是一个重点关注的问题，光毒性会导致 DNA 损伤、线粒体退化、细胞质内活性氧 (ROS) 形成、过氧化物产生、Hsp70 基因表达等一系列的促凋亡反应[6]，是遗传工程金黄仓鼠规模化研究应用的重要技术瓶颈之一。
2.2 创新点
根据金黄仓鼠胚胎对光照、温度的敏感因素及工作经验，建立金黄仓鼠专用生殖实验室。创新一：通过合理布局实验室仪器位置，增加升温设备，保证环境温度的稳定性，实现配子或胚胎在不同仪器间快速转运。创新二：金黄仓鼠早期胚胎对光源异常敏感，光的波长越短影响越大，通过改造实验室及仪器光源颜色，选用肉眼可见最长光波的红色光源操作胚胎，减少光毒性，延长配子或早期胚胎体外操作时效。
3 实验室布局与光源改造
3.1 实验室布局
金黄仓鼠卵子及早期胚胎对多重环境因素敏感，为便于微环境调控，实验室空间不宜过大，控制在10㎡以内。基因编辑显微操作实验室主要仪器有超净工作台、冰箱、体式显微镜、细胞培养箱、显微操作系统、加热风机等。根据胚胎基因编辑实验流程，将前期准备所用仪器冰箱及超净工作台放置在实验室左边。胚胎操作仪器摆放以细胞培养箱为中间仪器，摆放在拐角处，与体式显微镜及显微操作系统形成一个三角关系，胚胎可在不同实验步骤中快速转运。加热风机置于入口处，当室内温度低于25℃时开启，可快速提升实验室整体温度，避免转运过程中产生过大的温度波动。红色照明灯远离胚胎操作区域，特别是需要长时间体外操作的显微注射区域（图1）。
图1 实验室整体布局示意图
3.2 光源改造
高效的动物基因编辑技术、实验动物品系的冷冻保存、微生物感染鼠生物净化均会涉及到早期胚胎操作，而金黄仓鼠早期胚胎对光源异常敏感，光的波长越短影响越大，本案例选用肉眼可见最长光波的红色光源操作胚胎。
1）实验室照明光源分为日光灯与红光灯（30W）两种，红灯设置在远离胚胎操作区，避免直射胚胎。
2）实验准备期间用正常光源照明，实验期间开启低瓦数红光照明，以看清物品为原则，照明强度越低越好（图2 A、B）。
3）胚胎移植手术台放置1台红光台灯，确保动物手术区域的照明强度。
4）在体式显微镜温台与操作台之间加装双层红色滤光片，显微操作仪在光源通路上增加两道滤光片，确保滤光效果（图2 C-E）。
注：A 实验室日光照明整体照；B 实验室红光照明整体照；C 体式显微镜操作台与温台之间加装红色滤光片；D 显微操作仪倒置显微镜滤光片位置增加红色滤光片；E 显微操作仪倒置显微镜激光器上方增加红色滤光片。
图2 实验室光源及显微镜光源改造
4 实验案例验证
实验室改造成功与否，需要经过各类型金黄仓鼠胚胎体外实验检验。根据常用生殖类实验，分别设置胚胎体外培养、显微注射、冷冻胚胎复苏培养及鲜胚生物净化四类验证实验，全面展示光源控制实验室在金黄仓鼠基因编辑与胚胎工程研究中的应用。
4.1 采用改造后的实验室及仪器获取的受精卵可成功越过二细胞阻滞，从受精卵一步法培养至囊胚期。
供体鼠（6-8周龄）在发情周期的第1天注射15 IU孕母马血清促性腺激素（PMSG）诱导超排卵，发情第 4 天与雄性仓鼠1:1合笼配繁（频次1次/周内），次日9:00镜检雌性阴道分泌物，有精子判定为交配供体。提前1天制备HECM-9培养微滴（图3 A），在37.5℃三气培养箱平衡过夜（10% CO2、5% O2、85% N2）。检精当天13:00左右麻醉（1.8ml/100g）后断颈处死供体雌鼠，暴露腹部剪取输卵管，置于培养微滴内，在解剖显微镜下，用眼科镊撕开输卵管壶腹部，释放出细胞团，加入30μl透明质酸酶消化处理3 -5 分钟（图3 B）。将受精卵在微滴内洗涤3次，用200×倒置显微镜剔除多核受精卵及未受精卵子（图3 C）。受精卵10-15枚/微滴在37.5℃三气培养箱，3.5天后胚胎均越过二细胞阻滞期，部分胚胎发育至囊胚期（图3 D）。
注：A 覆盖石蜡油的培养微滴；B 在培养微滴内从输卵管壶腹部取受精卵；C 受精卵；D 体外培养的囊胚期胚胎。
图3 金黄仓鼠取卵及早期胚胎示意图
4.2 在胚胎二细胞期注射基因编辑样品到单个卵裂球或双卵裂球均可以成功体外发育到四细胞期胚胎。
二细胞胚胎在注射表达tdTomato重组荧光蛋白的基因编辑样品后培养至四细胞期，荧光显微镜下可观察到红色荧光表达[7]。注射二细胞胚胎中的一个卵裂球，发育到四细胞期可观察到单个胚胎二分之一的卵裂球细胞膜表达红色荧光（图4 A1、A2）。两个卵裂球同时注射，在四细胞期可观察到部分胚胎的四个细胞均表达红色荧光（图4 B1、B2），证明实验设施体系可满足早期胚胎基因显微注射类科学研究工作。
注：A 二细胞期单个卵裂球注射培养至四细胞期荧光观察；B 二细胞期双卵裂球注射培养至四细胞期荧光观察。
图4 二细胞胚胎显微注射荧光观察
4.3 二细胞期仓胚胎经冻存管超低温（液氮，-196℃）冷冻复苏后可体外培养发育至囊胚期。
复苏后胚胎发育潜能是胚胎冻存成功与否的重要标准[8-9]，本案例冷冻方法以1.5 ml细胞冻存管为冷冻载体，10%ED(乙二醇、DMSO)预处理30秒，EDFS30处理二细胞胚胎20秒后直接投入液氮保存的玻璃化胚胎冷冻法。复苏采用两步梯度法，用0.5mol/L 蔗糖（SU）溶解并吸出胚胎混合液放在培养皿上，利用口吸管将胚胎转移0.25mol/L SU内3分钟进一步恢复后移入培养液内培养，通过严格的操作外环境控制，冻存胚成功在体外培养至囊胚期（图5 F）。
注：A 冻存管冷冻胚胎位置及形态；B 液氮罐内产期保存；C 胚胎冻存管内复苏；D 两步法捡卵复苏流程；E 复苏胚发育至桑椹期；F 复苏胚发育至囊胚期。
图5 胚胎冷冻与复苏培养示意图
4.4 实现不同区域金黄仓鼠胚胎的转运移植，完成金黄仓鼠生物净化操作。
生物净化是利用药物或生殖屏障去除可能影响实验结果的病原体，从而使动物达到无特定病原菌要求[10]，胚胎移植技术是现今实验动物生物净化最高效安全的方法。金黄仓鼠受胚胎外环境敏感性问题，生物净化技术一直停留在剖腹产净化阶段[11]，利用本案例实验条件结合真孕受体移植技术（图6），分别进行了移植受精卵和二细胞胚胎移植对比，受精卵移植供胚仔率11%、活仔率为92%，二细胞期胚胎移植供胚仔率14%、活仔率为83%，两组数据无显著差异（P＞0.05，表1）。
注：A 胚胎移植时受体皮肤及肌肉层开口位置；B 卵巢输卵管取材后；C 镜下组织及移植位置标定；D 输卵管内气泡是移植成功的重要标志；E 产仔首日通过眼睛色素判定供胚发育小仔，黑色为移植后代；F 1周后可通过毛色辨别小仔来源。
图6 胚胎移植方法及后代小仔辨别
表1 不同发育时期胚胎移植产仔统计
移植分 组组 | 移植受体 | 移植胚胎数 | 未产仔受体数（%） | 供胚产 仔数（%） | 供胚受体得仔数(只） | 受体产仔数 | 受体得仔数(只） | 供胚存活数（%） |
受精卵 移植 | 29 | 456 | 4(14) | 51(11) | 1.76 | 176 | 6.07 | 47(92) |
二细胞 移植 | 120 | 1926 | 13(11) | 263(14) | 2.19 | 715 | 5.96 | 219(83) |
5 总结
围绕基因编辑金黄仓鼠开展的研究工作，已在生殖医学、脂代谢、心血管等领域取得了很多重要的研究结果[2-3]。但金黄仓鼠基因编辑开发和应用的过程依然困难重重，金黄仓鼠胚胎对光照、温度和pH 值变化等环境因素非常敏感，胚胎体外操作，易形成二细胞胚胎阻滞影响各类型研究工作，体外长期实验类研究影响更甚。早期胚胎体很多实验手段对胚胎发育影响更甚，如胚胎冷冻复苏对胚胎卵裂球的细胞骨架、细胞膜等均产生严重的伤害，其冻存效果受冷冻环境、方法冻存液、操作人员等多因素影响[8]。因此，实验室建设成功与否必须进行多重实验检验，本案例通过实验室光源及温控改造很好的克服了体外培养问题，经过胚胎培养、显微注射、冷冻复苏及移植实验验证，证明金黄仓鼠胚胎工程实验室建设是成功可行的。
设施设备在很大程度上影响着科研效率与科研质量，符合科学逻辑的实验室改造建设能有力推动科学研究进展。目前以本案例为基础建立的基因编辑金黄仓鼠应用研究平台已初见规模，构建的基因编辑金黄仓鼠品系在生殖生物学、SARS-CoV-2、代谢等研究应用中获得一系列重要的原创研究成果[4]，获批基因修饰金黄仓鼠相关科研项目8项，荣获市厅级研究成果奖1项。未来，将进一步完善金黄仓鼠胚胎工程技术体系建设，推动金黄仓鼠在生命科学研究领域的应用与发展，打造成具有重要影响力的金黄仓鼠研究应用基地。
参考文献
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