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【金秋计划】+电荷异构体的馏分收集(IEX-HPLC法)

  • 通标小菜鸟
    2024/09/04
  • 私聊

前处理综合讨论

  • 单克隆抗体在生产及存储过程中会由于抗体分子自身性质、环境应力、储存方式等因素,而发生复杂的翻译后修饰,如氧化、脱酰胺、糖基化、C末端赖氨酸切除、N末端焦谷氨酸化、降解/聚合等,造成抗体在电荷分布方面高度的异质性。电荷异构体的产生会影响抗体药物的结合能力、生物学活性、免疫原性以及结构稳定性等,进而影响抗体药物的药物代谢动力学、安全性和有效性。电荷变化的复杂性常常给评估完整的电荷变化概况带来巨大的挑战。

    目前,有多种方式(IEX-HPLC、FFE、icIEF等)对电荷异构体进行馏分收集,从而进一步对产品进行表征。奕安济世生物药业理化分析平台具有成熟的IEX-HPLC馏分收集技术,可获得较高的目标收集组分含量,馏分收集纯度1(IEX-HPLC)可达85%以上。收集装置如图1所示,主要是由HPLC和馏分收集器串联组成。


    图1. IEX-HPLC馏分收集系统

    为提高馏分收集效率,前期一般需要在所用原始分析方法(IEX-HPLC)基础上进行优化,在保持主洗脱梯度程序不变的情况下,缩短方法的平衡时间,增加进样质量。其中,在不改变进样器定量环体积基础上,通过叠加多次进样然后一次洗脱的方式以增加进样质量,可大大提高目标组分的收集效率。图2展示了不同进样质量的CEX-HPLC色谱图,单次进样/洗脱的抗体质量可达9 mg。


    图2. 叠加进样及收集区域

    为了提高目标组分的收集效率,采用进样9 mg的抗体质量进行馏分收集,收集区域如图2(下)所示。将盲收2得到的馏分样品结合二次精制的方式,再经系列换液、浓缩,最终得到的目标收集组分经CEX-HPLC检测图谱如图3所示,馏分收集纯度见表1。其中第二个碱性峰的(Basic Fraction 2)由于发生N端焦谷氨酸环化,导致其收集纯度降低,其余馏分收集样品纯度可达90%以上。


    图3. 馏分收集样品CEX-HPLC检测结果叠图

    表1. 馏分收集纯度



    馏分收集样品的纯度达到后续表征研究要求后,需对其进行储存条件进行稳定性评估。以确保其质量在表征研究过程中,未发生明显改变。馏分收集后的样品将进一步用于表征研究,对CQA评估、工艺变更、产品批次间差异、质量标准制定等具有重要的指导意义。
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