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【金秋计划】轻松拿捏“胶回收DNA”
Ins_d6b56fa6
2024/09/06
私聊
实验室管理/LIMS
一、割胶回收原理
DNA
经琼脂糖凝胶电泳后,切下要回收的含
DNA
的琼脂块,采用
DNA
胶回收试剂盒回收
DNA
。
琼脂糖凝胶块在凝胶溶胶液中被迅速熔化并释放出
DNA
,
DNA
片断被选择性吸附到硅胶膜上,经
DNA漂洗液
洗涤去除残留在硅胶膜上的杂质和高浓度盐离子后,吸附到硅胶膜上的
DNA
片断经微量水或
DNA
洗脱液洗脱下来。该方法回收率高且不降解
DNA
,操作简单、快速、方便,纯化的
DNA
适合于任何分子生物学操作(如酶切、克隆、测序等)。
二、
DNA
胶回收试剂盒中各试剂的作用
1.
溶胶液:
溶解琼脂糖凝胶并保持
DNA
的稳定性。
溶胶液中通常含有
Tris-HCl
(提供一个温和的
pH
环境,保护
DNA
不被降解),
EDTA
(螯合金属离子如
Mg
2?和
Ca
2?,抑制核酸酶活性),
SDS
或
Tween-20
(溶解细胞膜和蛋白质,释放
DNA
),
NaCl
,
β
-巯基乙醇等。
2.
漂洗液:
去除杂质、盐类和其他不需要的物质,确保回收的DNA有较高的纯度。
漂洗液中通常含有乙醇(沉淀DNA、去除杂质),缓冲盐(维持pH),去污剂(除杂质),螯合剂(螯合金属离子)等。
3.
洗脱液:
溶解吸附在柱子上的
DNA
。
漂洗
液中通常含有超纯水(溶解DNA),缓冲剂(维持pH),螯合剂(螯合金属离子)等。
三、
DNA
胶回收详细步骤
1.核酸电泳:
琼脂糖凝胶电泳参照相关内容。
2.割胶:
琼脂糖凝胶电泳后,用手术刀将目的
DNA
片段的琼脂块割下(尽量切除多余部分),称量琼脂块的重量。
称量琼脂快的目的是为了确定溶胶液的体积。
3.添加溶胶液:
将琼脂块放在离心管内用
1mL
枪头捣碎,加入3倍体积的溶胶液(如胶为
100mg
,则加
30
0μL
溶胶液),颠倒混匀,
50-55℃
水浴加热约
10min
至胶全熔。其间,需颠倒混匀三四次,以加速凝胶熔解。
胶溶时间的长短克根据胶碎片大小确定,确保全熔即可。
溶胶时,如果溶胶液变为红色(正常情况下为淡黄色),可向含有 DNA 的胶溶液中加入 10-30
μL
3M
醋酸钠(pH5.2)将胶溶液调为淡黄色,否则将会影响
DNA
与吸附柱的结合,影响回收效率。DNA在溶胶液中。
4.添加漂洗液:
向吸附柱中加入
600μL
漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),
12000rpm
离心
1
min
,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
这一步离心力一定要达到12000g,较低离心速度会导致DNA回收效率下降。DNA在吸附柱上。
5.添加漂洗液:
向吸附柱中加入
600
μL漂洗液,
12000rpm
离心
1min
,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
再次除杂质,提高DNA纯度。
6.干燥:
12000rpm
离心
2min
,尽量除去漂洗液。将吸附柱敞口置于室温或
50
℃
培养箱中放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,防止漂洗液中的乙醇影响后续的实验。
残留乙醇可能会影响DNA的稳定性,影响转化效率、影响基因表达等。
7.添加洗脱液洗脱:
将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加适量经
65℃
水浴预热的洗脱液,室温放置
2min,12000rpm 离心 1min
。
洗脱液预热可以提高DNA的洗脱效率,缩短洗脱时间,有助于提高DNA的回收质量和产量。
8.收集储存
DNA
:
将收集到 的
DNA
洗脱液储存于
-20℃或
-
80℃
。
四、试验技巧和注意事项
1.试验技巧
按部就班。目前市面上有很多厂家试剂盒,按照说明书一步一步操作,切勿张冠李戴,影响试验结果。
2.温度
溶胶温度、干燥温度、洗脱温度都要把控好,避免高温导致DNA变性或乙醇残留等。
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