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【金秋计划】淫羊藿素结合并抑制PADI2介导的中性粒细胞浸润和NET形成抑制尿路上皮癌进展

城头变幻大王骑

2024/09/10

中药/天然药检测

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是传统中药淫羊藿的主要活性成分，在体内会被代谢为淫羊藿素（Icaritin，ICT）发挥作用。2022年，以ICT为主要成分的Icaritin胶囊获得NMPA批准用于晚期无法手术的肝细胞癌的一线治疗。ICT不仅通过诱导细胞凋亡和自噬直接作用杀死肿瘤，而且调节肿瘤免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。然而，ICT调节TME的具体机制，特别是在尿路上皮癌中，尚不完全清楚。

淫羊藿素（ICT）通过减少肿瘤微环境中NET（中性粒细胞胞外诱捕网）的形成和中性粒细胞浸润来预防尿路上皮癌转移。机制上，在中性粒细胞中，ICT结合并抑制PADI2介导的组蛋白瓜氨酸化。此外，ICT抑制ROS的产生，抑制MAPK信号通路，抑制NET诱导的肿瘤转移。同时，在肿瘤细胞中，ICT抑制肿瘤PADI2诱导的组蛋白瓜氨酸化，从而降低IL-6转录，IL-6表达的下调通过 JAK2/STAT3/IL-6 轴形成调节反馈回路并限制中性粒细胞募集。

1、ICT在体外抑制尿路上皮癌细胞的恶性生物学行为

为阐明ICT对肿瘤的调控机制，作者通过体外实验（CCK8、集落形成、流式细胞术、划痕和Transwel等）评估了ICT对恶性生物学特性的抑制作用。结果显示ICT显著抑制多种尿路上皮癌细胞系的细胞活力，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期停滞。这些体外研究结果证明了ICT作为抗肿瘤药物的潜力

2、ICT抑制体内中性粒细胞浸润来抑制肿瘤转移

进一步作者研究了ICT对尿路上皮癌的体内抗肿瘤功效。通过皮下肿瘤模型发现ICT抑制肿瘤增长，增强细胞毒性T细胞和M1型巨噬细胞的浸润，促进抗肿瘤免疫效应分子的分泌，显著抑制中性粒细胞浸润。尾静脉肺转移试验显示，ICT在体内显著抑制肿瘤转移，而在中性粒细胞耗竭后，这种对转移的抑制作用减弱。此外，在CD4或CD8 T细胞单独耗竭后，对肿瘤转移的抑制仍然存在。结果表明ICT调节肿瘤免疫微环境中的中性粒细胞，从而通过抑制中性粒细胞浸润来增强抗肿瘤免疫。

3、ICT逆转NET介导的肿瘤上皮-间充质转化（EMT）和干性以抑制转移

中性粒细胞胞外陷阱（NET）作为中性粒细胞中NETosis的产物，在介导肿瘤免疫微环境中的免疫抑制中起着关键作用。作者发现NET标志物组蛋白3瓜氨酸化（H3CIT）和髓过氧化物酶（MPO）的表达显著降低，进一步通过体外共培养系统发现PMA诱导的NET形成增强了肿瘤的侵袭和转移，而ICT有效逆转了这一作用。此外，DNase I（一种NET降解剂）与ICT表现出协同作用。体内实验进一步证实了ICT对NET形成的抑制作用。接着作者检查了共培养后肿瘤的EMT表型，发现ICT不仅能抑制中性粒细胞浸润，还能有效抑制NET形成，从而抑制NET介导的肿瘤EMT和干性。

4、ICT 通过靶向 PADI2 和抑制自杀性 NETosis 来抑制 NET 的形成

为了研究ICT抑制NET形成的机制，作者分离CD45CD11b中性粒细胞，用ICT处理，并进行RNA-seq分析。功能富集分析表明，ICT调节了与NET形成和趋化因子信号传导相关的通路，差异基因表达分析显示PADI2表达显著降低，PADI2是一种与组蛋白瓜氨酸化和 NET形成相关的基因。分子对接实验表明，ICT可以在六个潜在位点与PADI2结合。相关性分析表明PADI2表达与中性粒细胞浸润有关。GSVA分析揭示PADI2表达与NET相关基因表达之间的相关性，从而得出了ICT介导的NET形成调控可能与PADI2相关的假设，并通过一系列实验证实ICT通过抑制自杀性NETosis和PADI2介导的组蛋白瓜氨酸化来抑制NET的形成。

5、ICT抑制PADI2介导的组蛋白瓜氨酸化和IL-6/JAK2/STAT3信号传导的正反馈回路来抑制中性粒细胞浸润

先前的研究表明，ICT不仅可以抑制NET的形成，还可以抑制中性粒细胞浸润。作者进一步剖析ICT抑制中性粒细胞浸润的机制，发现ICT处理后与中性粒细胞募集相关的几种细胞因子下调，功能富集分析表明这种抑制可能与JAK/STAT信号通路有关。体外中性粒细胞-肿瘤共培养系统发现ICT处理后招募到下腔室的中性粒细胞数量减少，IL-6和IL-8的转录在不同肿瘤细胞系中受到抑制。鉴于PADI2介导的组蛋白瓜氨酸化可以增强IL-6的转录，ICT与PADI2抑制剂AFM32a的组合用于进一步的机制探索，发现ICT 同样抑制肿瘤内PADI2的表达，并且抑制PADI2表达导致肿瘤细胞内组蛋白瓜氨酸化减少，导致 IL-6 转录的下游减少并阻碍中性粒细胞募集。IL-6水平降低可进一步抑制JAK2/STAT3信号通路，从而破坏IL-6的正转录反馈回路。

6、PADI2介导的NETs对尿路上皮癌具有预后价值

为了验证PADI2介导的NET是尿路上皮癌的预后生物标志物，作者收集了尿路上皮癌患者的组织和血液样本进行相关性分析。结果显示NET标志物CD66b和NET标志物H3CIT的联合分析显示，两种标志物高表达的患者预后最差，且中性粒细胞浸润与化疗耐药性相关。肌层浸润性膀胱癌患者的MPO-DNA水平高于非肌层浸润性膀胱癌患者，且手术后血浆 MPO-DNA 升高的患者往往会复发。这些结果强调了中性粒细胞NE相关成分在预测尿路上皮癌复发和进展方面的潜力。

7、ICT与抗PD-1免疫疗法协同作用，以抵消NET诱导的T细胞耗竭

既往研究证实，中性粒细胞和NET可以抑制肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤功能，诱导T细胞耗竭，导致免疫逃逸。因此，作者分析了肿瘤中中性粒细胞、NETs和T细胞耗竭之间的关系。相关性分析显示，肿瘤中中性粒细胞浸润和NET与T细胞浸润增加有关。然而，PD-1的表达也升高。流式细胞术显示CD66b浸润与PD-1和CD8TIM3表达上调相关，表明中性粒细胞高浸润与免疫衰竭之间存在关联。作者进一步探讨了ICT是否可以与抗PD1疗法联合使用以逆转T细胞耗竭，发现ICT与抗PD-1治疗联合现在减少了肿瘤生长并改善了小鼠的预后。这些结果证实了ICT可以通过抑制中性粒细胞和NET的形成来重塑免疫微环境，从而逆转肿瘤免疫逃逸。ICT和抗PD-1免疫疗法的联合应用可以协同作用，增强抗肿瘤免疫力。

总结

该研究证明了淫羊藿素是晚期和无法治愈的肝细胞癌的一线治疗方法，可减少自杀性 NETosis 引起的NET，并防止肿瘤微环境中的中性粒细胞浸润。从机制上讲，ICT结合并抑制中性粒细胞中PADI2的表达，从而抑制PADI2介导的组蛋白瓜氨酸化。此外，ICT抑制ROS的产生，抑制MAPK信号通路，抑制NET诱导的肿瘤转移。同时，ICT 抑制肿瘤PADI2 介导的组蛋白瓜氨酸化，从而抑制中性粒细胞募集基因（如GM-CSF 和 IL-6）的转录。反过来，IL-6 表达的下调通过JAK2/STAT3/IL-6 轴形成调节反馈回路。通过对临床样本的回顾性研究，我们发现中性粒细胞、NET、UCa预后和免疫逃逸之间存在相关性。ICT与免疫检查点抑制剂联合使用可能具有协同效应。总之，研究表明ICT可以成为NETs的新型抑制剂和一种新的UCa治疗方法。

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