a. 缓冲液的选择和pH范围:选择合适的缓冲液体系对于pH梯度洗脱至关重要。缓冲液需要能够在较宽的pH范围内保持稳定,以实现连续变化的pH梯度。例如,磷酸盐缓冲体系是一种常用的缓冲系统,它具有较宽的pH范围(一般为pH 5.7到8.0),适用于多种分析需求。
b 缓冲液的浓度:缓冲液的浓度会影响洗脱的效率和分辨率。过高的浓度可能会影响柱寿命和系统压力,而过低的浓度可能降低分离效果。需要通过实验找到最佳的缓冲液浓度,以获得最佳的分析结果。
c. 梯度程序的设置:梯度程序的设置包括梯度的起始和结束点,以及梯度的变化速率。这些参数需要根据分析物的特性和分离目标来优化。例如,可以通过改变pH梯度的起始和结束点,以及梯度的斜率,来优化分离效果。
d 检测器的兼容性:在pH梯度洗脱中,需要确保所使用的检测器能够与流动相的pH变化兼容。例如,某些检测器可能对pH变化敏感,需要选择能够在所需pH范围内稳定工作的检测器。
②.盐梯度洗脱下
a. 流动相的组成:选择合适的流动相组成是盐浓度梯度洗脱中的关键。流动相通常由水和有机溶剂(如甲醇、乙腈等)组成,并通过调节溶剂的组成来实现梯度洗脱。对于极性物质的分离,可以选择水-有机溶剂的混合物作为流动相;而对于非极性物质的分离,则可以选择含有缓冲剂的溶液作为流动相。 b. 梯度程序的设置:梯度程序的设置包括梯度的起始和结束点,以及梯度的变化速率。这些参数需要根据分析物的特性和分离目标来优化。梯度程序的优化可以提高分离效率,缩短分析时间,并提高分辨率。(跟pH相似) c. 流速的选择:流速的选择会影响分离效果和分析时间。较高的流速可以缩短分析时间,但可能会降低分离效率。流速的优化需要考虑到分离效果、分析时间和系统压力之间的关系。 d. 检测器的兼容性:在盐浓度梯度洗脱中,需要确保所使用的检测器能够与流动相的盐浓度变化兼容。例如,某些检测器可能对盐浓度变化敏感,需要选择能够在所需盐浓度范围内稳定工作的检测器。 4)缓冲液体系的考量 a. pH梯度洗脱的缓冲液体系pH梯度洗脱通常需要一个能够在较宽pH范围内保持稳定和缓冲能力的缓冲液体系。这种体系通常由两种或多种具有不同pKa值的缓冲剂组成,以实现从低pH到高pH的连续变化。常用的缓冲液包括: