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高效液相色谱方法开发篇|关于RPC的方法开发小知识

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2024/10/15

液相色谱（LC）

之前在《关于分析方法建立的一般步骤的小知识》文章中已经对分析方法开发的一般步骤进行了大概的说明，现在主要是对不同类型的方法开发做一个大致的推荐。
01.反相方法开发的一般步骤
1）评估样品的组成和分离目标：确定样品中需要分离和检测的化合物；了解样品的化学性质，包括极性、分子量、稳定性等；确定分离目标，比如检测限、定量限、分离度等。
2）对样品进行预处理：根据样品性质选择合适的溶剂进行溶解；去除样品中的杂质或干扰物，如蛋白质沉淀、离心或过滤；如果需要，进行样品浓缩或稀释，以适应色谱系统的要求。
3）选择色谱模式：对于中性样品，通常选择反相色谱（RPC）；确定使用何种固定相，如C18或C8；选择流动相的组成，通常是水和有机溶剂的混合物。
4）选择检测器：根据样品的化学性质和检测需求选择合适的检测器，如紫外-可见光（UV-Vis）、荧光检测器或质谱（MS）；确定检测器的参数设置，如波长、流通池体积等。
5）选择分离条件：确定流动相的组成，包括有机溶剂的类型和比例；设定流速，通常在0.5-2.0 mL/min之间；设定柱温，以优化分离效果；设计梯度洗脱程序，以实现不同极性化合物的分离。
6）预料、识别和解决潜在问题：预料可能出现的问题，如柱堵塞、样品降解、峰形不佳等；识别问题的原因，如样品溶剂不兼容、流动相污染等；解决问题，如更换色谱柱、优化流动相组成、调整样品处理方法等。
7）进行方法的部分验证和系统稳定性测试：进行系统适用性测试，包括理论板数、拖尾因子和分离度；进行部分方法验证，包括准确度、精密度、线性范围、检测限和定量限、耐用性；测试系统稳定性，包括连续运行条件下的系统变异性。
8）优化和调整：根据初步实验结果，优化分离条件，如调整流动相比例、流速或柱温；调整检测器参数，以提高灵敏度和选择性。
9）最终验证：进行全面的方法验证，包括交叉验证和独立实验室验证；确定方法的可靠性和重现性。

02.反相色谱法分离样品推荐使用的实验条件
1）分离中性样品的推荐条件（等度）

a.也可选用一根 150mm x 4.6mm，粒径大小为5μm的柱子；流动相流速、柱子大小和颗粒尺寸都可以改变，这取决于分离实验所预期的难易程度和柱子所能承受的最大压力。

b.最初的值，可能会在方法建立的过程中被改变；流速一般也会根据你流动相溶剂的选择而进行调整（一般大多数都是在0.5~1.0ml/min之间）；大多数分离实验里推荐使用高于室温 5-10℃作为实际的温度。同时也务必注意柱子生产厂商所推荐的柱子使用最高温度极限。

c. 因样品而异；以 80%B作为起始浓度，可以根据经验做进一步调整。

2）分离离子化合物样品的推荐条件（等度）

a.也可选用一根 150mm x 4.6mm，粒径大小为5μm的柱子；流动相流速、柱子大小和颗粒尺寸都可以改变，这取决于分离实验所预期的难易程度和柱子所能承受的最大压力。注意的是在开始建立方法时必须使用新的柱子。

b.最初的值，可能会在方法建立的过程中被改变；流速一般也会根据你流动相溶剂的选择而进行调整（一般大多数都是在0.5~1.0ml/min之间）；大多数分离实验里推荐使用高于室温 5-10℃作为实际的温度。同时也务必注意柱子生产厂商所推荐的柱子使用最高温度极限。

c. 因样品而异；以 80%B作为起始浓度，可以根据经验做进一步调整。

3）分离蛋白类样品的推荐条件（梯度）

a.也可选用一根 150mm x 4.6mm，粒径大小为5μm的柱子；流动相流速、柱子大小和颗粒尺寸都可以改变，这取决于分离实验所预期的难易程度和柱子所能承受的最大压力。注意的是在开始建立方法时必须使用新的柱子。

b.最初的值，可能会在方法建立的过程中被改变；流速一般也会根据你流动相溶剂的选择而进行调整（一般大多数都是在0.5~1.0ml/min之间）；大多数分离实验里推荐使用高于室温 5-10℃作为实际的温度。同时也务必注意柱子生产厂商所推荐的柱子使用最高温度极限。

c. 因样品而异；以 90%A作为起始浓度，可以根据经验做进一步调整。

03.反相方法开发的注意事项

1) 流动相的组成：流动相的组成（如水/乙腈或水/甲醇的比例）对样品的保留时间、分离度和峰形有显著影响。流动相的极性、pH值和添加剂（如离子对试剂）都需要仔细选择。

2) 检测器的选择：根据样品的紫外-可见吸收特性选择合适的检测波长(注意溶剂的截止波长)。确保流动相在所选波长下没有吸收，以避免基线噪音和漂移。

3) 流速的选择：流速会影响分离度和分析时间。通常，降低流速可以提高分离度，但会增加分析时间。（在满足分离度的情况下，尽可能的大流速，缩短分析时间，毕竟时间也是成本）

4）柱温的选择：柱温对分离选择性有显著影响。升高柱温通常会降低蛋白质的保留时间，并且可能改善峰形和分离度。

5）梯度洗脱的优化：梯度洗脱可以通过改变流动相中有机溶剂的比例来实现样品的分离。优化梯度斜率、流速和组成对于获得良好的分离效果至关重要。（可以线性梯度，也可以分段梯度，主要看化合物的分离情况）

总结一下：在开发反相色谱方法时，首先要了解样品的特性和分离目标，比如要分析的化合物、样品的化学性质和所需的检测灵敏度等。如果样品需要处理，则需对样品进行适当的预处理，比如溶解、去杂质和浓缩。然后，选择合适的色谱柱（如C18、C8）和流动相，通常是水和有机溶剂的混合，以及检测器（如UV或DAD）。在实验条件上，要调整流动相的组成、流速、柱温和梯度洗脱程序，以达到最佳的分离效果。过程中要注意流动相的极性、pH值、检测器的波长选择、流速对分离度的影响，以及柱温对蛋白质保留时间的作用。最后，要进行方法验证和优化，确保分离方法的可靠性和重现性。简单来说，就是要根据样品的特性来调整色谱条件，通过实验找到最合适的分析方法。

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