a. 分辨率与流速的关系:在尺寸排阻色谱中,降低流速可以提高分辨率,因为这有助于减少扩散和提高分子在柱内的停留时间,从而实现更好的分离。然而,较低的流速也会增加分析时间,因此需要在分辨率和分析效率之间找到平衡。
b. 系统压力与流速的关系:较高的流速可能会增加系统压力,特别是当使用较长的柱子或较小的粒径的填料时。系统压力的增加可能导致泵性能下降或柱子损坏,因此需要监控并优化流速以保持在系统的压力限制内;SEC色谱柱耐压一般都较小。
c. 样品性质与流速的关系:不同的样品可能需要不同的流速来实现最佳分离。例如,对于较大的蛋白质或聚合物,可能需要较高的流速来减少扩散和保持合理的分析时间。
2)柱温的优化
a. 保留时间与柱温的关系:理论上,在SEC中温度对保留时间没有影响,因为SEC分离是基于熵驱动的分配过程,而非吸附过程。然而,在实际操作中,温度可能会通过改变蛋白质的构象间接影响保留时间。
b. 流动相粘度与柱温的关系:温度的升高通常会降低流动相的粘度,从而增加分子在柱内的扩散性。这可能会影响分离效率和分辨率。
c. 分析时间与柱温的关系:在某些情况下,提高柱温可以减少分析时间,但这可能会以牺牲分辨率为代价。
d. 系统压力与柱温的关系:提高柱温通常会降低流动相的粘度,从而降低系统压力,但在实际操作中,如果柱温升高导致样品的溶解度降低或色谱柱的性能下降,可能会间接增加系统的压力。SEC分离通常在10~30℃下进行。
e. 样品稳定性与柱温的关系:在方法开发过程中,需要确保所选的柱温不会影响样品的稳定性,特别是在分析温度敏感的生物分子时。
3)流动相的优化
a. 缓冲盐组成与流动相的关系:流动相通常由水相缓冲液组成,如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液,常与氯化钠等盐类配合使用。有时,对于特定的生物分子,可能还会添加有机溶剂,如乙腈或甲醇。优化缓冲液和盐浓度是最大程度提高色谱柱分离效果的关键部分,其目的在于避免造成峰拖尾、峰变形、分离度不佳的次级相互作用以及由流动相引起的蛋白质聚集 。
b. 离子强度与流动相的关系:调整流动相的离子强度可以减少填料与蛋白质之间的次级相互作用。例如,增加氯化钠的浓度可以减少单体的峰拖尾现象并使峰形更窄 。
c. pH与流动相的关系:流动相的pH值对蛋白质的电荷状态和因此与其与填料的相互作用有显著影响。选择合适的pH值可以优化蛋白质的分离 。
d. 缓冲液浓度与流动相的关系:缓冲液的浓度也会影响蛋白质的分离。过高的缓冲液浓度可能导致蛋白质聚集,从而影响分析结果。通常,较低的缓冲液浓度有利于获得更好的分离效果 。