【飞诺美色谱】薯片和油条中丙烯酰胺的分析方法

摘要：本实验参照《食品中丙烯酰胺的测定》GB 5009.204-2014 中第一法——稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）对油炸食品中丙烯酰胺进行测定，考虑到国标法中前处理过程存在操作步骤繁琐，操作时间长等问题，改用 Cleanert ® ACA 固相萃取柱一次净化，Venusil ® MP C18 色谱柱（2.1 × 150 mm，5 µm，100 Å）分离，0.1%的甲酸水溶液作为流动相洗脱，三重四级杆质谱检测，内标法进行定量，取得了较好的实验结果。结果表明：该方法不仅简化了前处理过程的实验操作步骤和降低了操作时间，而且使样品的净化效果更好，减小了样品的基质效应。当丙烯酰胺的加标量分别为 0.1 mg/kg、2 mg/kg 时，回收率均在 100% ~ 110%之间，可以满足检测要求。

关键词：LC-MS/MS；丙烯酰胺；Cleanert ® ACA； Venusil ® MP C18

前言

丙烯酰胺（acylamide；CAS 登记号 79-06-1）是一种无色、无臭透明片状晶体；可溶于水、醇、丙酮、醚和三氯甲烷，微溶于甲苯，不溶于苯和庚烷。相对分子质量为 71.08，结构式如图 1 所示。丙烯酰胺是一种公认的神经毒素和准致癌物，动物实验和体外细胞实验都证明丙烯酰胺还可导致遗传物质发生改变，早在 2005 年国际癌症研究机构就已将其列为 2A 级致癌物质。2002 年 4 月，瑞典国家食品管理局发现许多含淀粉的食物经过煎、烤、炸等高温烹调后会产生高含量的丙烯酰胺。众多研究表明薯条、薯片等土豆制品中丙烯酰胺的含量最高，超过饮用水中允许最大限度的 500 多倍。

因此通过有效的实验技术手段，对食品中的丙烯酰胺进行监控，以确保消费者对食品消费的安全具有重要意义。本实验参照国标法一法，使用 Cleanert ® ACA 固相萃取柱对样品净化，建立了快速、有效的食品中丙烯酰胺的 LC-MS/MS 检测方法。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

AB SCIEX API 4000+液相质谱联用仪；

Qdaura ® 卓睿全自动固相萃取仪；

试剂材料

某品牌原味薯片、油条；

甲酸、甲醇、正己烷皆为色谱纯；屈臣氏水；

丙烯酰胺标准品（纯度 > 99%），水溶解；

D 3 -丙烯酰胺标准溶液（CD 2 =CDCONH 2 ）（浓度 500 mg/L，溶剂乙腈）;

基质标准工作溶液：

0.1%甲酸溶液：移取 100 µL 甲酸并加入 100 mL 水，摇匀；

一次性无菌注射器；尼龙针式过滤器(0.22 µm，直径 13 mm)；

Cleanert ® ACA 固相萃取柱：200 mg/6 mL。

样品制备

样品提取

准确称取粉碎后的 1 g 样品置于 50 mL 离心管中，加入 200 µL D 3 -丙烯酰胺内标（1 mg/L），再加入 10 mL 水，超声振荡 30 min 后，于 8000 r/min 离心 5 min，将上清液转移到 15 mL 离心管中，加入 5 mL 正己烷，漩涡萃取 1 min，以 6000 r/min的速度离心 5 min，除去上层有机相，再用 5 mL 正己烷重复萃取一次，之后迅速取5 mL 水相作为上样液。

样品净化

手动操作

Cleanert ® ACA 固相萃取柱（200 mg/6 mL）使用前依次用 5 mL 甲醇、5 mL 水活化，将上样液上 Cleanert ® ACA 固相萃取柱，并用 5 mL 水洗涤，真空抽干小柱，用 5 mL 甲醇洗脱，并收集全部洗脱液，于 40℃下氮吹浓缩至近干，用水定容至 1 mL，待 LC-MS/MS 检测。

Qdaura ® 卓睿全自动固相萃取仪操作程序

先将 Cleanert ® ACA 固相萃取柱安装在仪器上，并将样品注入到上样管里，按下图中程序自动操作：

色谱条件

液相条件

色谱柱：Venusil ® MP C18，5 µm，100 Å，2.1 × 150 mm；

流动相：0.1%甲酸水溶液；

柱 温：26℃；

流 速：0.2 mL/min；

进样量：2 µL。

质谱条件

离子源：ESI + ；电喷雾电压：5500 V；雾化气压力：45 psi；气帘气压力：10 psi；

辅助气压力：45 psi；离子源温度：330℃；采集方式：多反应监测(MRM)。

结果与讨论

线性关系

分别配制浓度为 0.01 mg/L、0.05 mg/ L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、3 mg/L的丙烯酰胺标准溶液（内标：0.1 mg/L），进行液相色谱-质谱/质谱检测，以各标准溶液的丙烯酰胺进样浓度（mg/L）为横坐标，以丙烯酰胺的峰面积与内标 D 3 -丙烯酰胺的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，如图 3 所示，拟合参数如表 2。

实验结果

由表 3 可知，采用 Cleanert ® ACA 固相萃取柱结合液相色谱-质谱/质谱法检测丙烯酰胺，当丙烯酰胺的加标量分别为 0.1 mg/kg 和 2 mg/kg 时，回收率均在 100% ~110%之间，满足检测要求。

结论

本实验参照《食品中丙烯酰胺的测定》GB 5009.204-2014 中第一法——稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法，使用 Cleanert ® ACA 固相萃取柱建立了食品中丙烯酰胺的检测方法，并用内标法结合 LC-MS/MS 对食品中丙烯酰胺含量进行了测定。当加标量为 0.1 mg/kg 和 2 mg/kg 时，回收率均在 100% ~ 110%之间，符合要求。该方法的定量限为 60 μg/kg。

讨论

与国标法相比，该方法具有诸多优点：

1、 从操作过程上说，该方法操作简单，只需要使用一根固相萃取柱，而国标法需要使用两根固相萃取柱；该方法操作时间短，前处理整个过程只需要 4 h，而国标法则需要 12 h 以上；

2 、 从净化效果上说，该方法除杂效果比国标法好，如下图所示为薯片基质用该方法和国标法处理的 LC-MS/MS 谱图，从图中可以看到国标法处理的杂质峰的峰高是该方法的 10 倍左右；

3、 从实验结果上说，该方法和国标法都存在基质效应（ME），且 ME < 100%，即皆为离子抑制效应。本实验方法对薯片和油条基质的 ME 分别为 90%和 87%，而国标法对薯片和油条基质的 ME 分别为 23%和 35%，本实验方法的 ME 更接近 100%，因此本实验的基质效应更小。从绝对回收率上看，本实验对薯片和油条的回收率分别为 76.6%和 63.4%，而国标法对薯片和油条的绝对回收率只有 22.3%和 32.7%。 （注：ME =（空白样品处理后加标响应峰面积-空白样品丙烯酰胺响应峰面积）/溶剂标响应峰面积。）

附：相关产品