概述
mRNA疫苗的研发难点之一是mRNA的免疫原性。mRNA作为外源物质，进入人体后会激活人体的免疫系统，进而引发由mRNA本身引起的炎症反应，并可能导致mRNA还未发挥作用就被免疫系统清除。引入天然修饰核苷酸是降低mRNA疫苗免疫原性的有效手段之一。
假尿苷（Pseudouridine）是RNA上最丰富的修饰核苷，又被称为RNA的“第五种核苷”。2005年，Katalin Karikó等人发现将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低。2008年，Katalin Karikó等人还发现用假尿苷完全替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力。2015年，Oliwia Andries等人发现用N1-甲基假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力。
这些研究提示，将假尿苷或N1-甲基假尿苷引入mRNA或许能有效降低mRNA疫苗的免疫原性，增强mRNA的稳定性，且增强其蛋白表达能力。
我们在IVT反应过程中，对反应体系中各种有效组分进行实时监控非常关键，为了对于体系中的几种三磷酸尿苷的类似物用液相色谱法快速检测，本文对分离条件进行了摸索和尝试。
关键词
尿苷类似物；离子对反相；Biphenyl.
化合物信息
实验部分
3.1仪器、试剂与材料
3.1.1主要仪器设备
超高效液相色谱色谱仪(Waters H-Class)；
3.1.2试剂材料
色谱柱: Kinetex 2.6um Biphenyl 100A，3.0*150mm
三乙胺，正己胺，磷酸为分析纯，甲醇为HPLC级，屈臣氏蒸馏水
3.2样品前处理方法
供试品溶液：取表一化合物原液（100mM）各20uL混合后，用纯水稀释成含各组分2mM的混标。
3.3仪器检测条件
3.3.1色谱条件
色谱柱：Kinetex Biphenyl 100A（3.0*150 mm, 2.6 μm）；P/N: 00F-4622-Y0
流动相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸调节pH至7.8）
流动相B：甲醇
梯度程序见表2：
流 速：0.5mL/min；
检测器：260 nm
柱 温：40 ℃；
自动进样器温度：8℃
进样量：1 µL
3.4结果
3.5实验谱图
3.5 讨论
本实验采用Kinetex Biphenyl 2.6um 色谱柱对尿苷三磷酸的修饰物单体进行分离。因为三个类似物的结构高度相似，特别是UTP和Me-pUTP，疏水性极为相似，用普通的C18反相色谱柱难以分离。
通过色谱柱筛选，我们发现Biphenyl固定相由于芳香族特殊的选择性，可以对几种同系物分离。
结论
实验结果表明， Kinetex Biphenyl 2.6um色谱柱可以对三磷酸尿苷和其类似物实现分离，该方法可以用于反应体系种组分的快速检测。
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