方案摘要
方案下载应用领域 | 制药/生物制药 |
检测样本 | 中药材和饮片 |
检测项目 | 含量测定>色谱法 |
参考标准 | 《中华人民共和国药典》2020版 |
阿胶为马科动物—驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。阿胶的主要成分是胶原蛋白,L-羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,其含量在胶原蛋白中比例固定,甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸在阿胶中的含量较高,仪电分析参照《中华人民共和国药典》2020版,使用配备梯度洗脱功能、紫外可见检测器的LC220高效液相色谱仪对阿胶中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种主要氨基酸指标成分进行含量测定。
【仪电分析】阿胶中四种氨基酸含量的测定-高效液相色谱法
阿胶为马科动物—驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。阿胶的主要成分是胶原蛋白,L-羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,其含量在胶原蛋白中比例固定,甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸在阿胶中的含量较高,仪电分析参照《中华人民共和国药典》2020版,使用配备梯度洗脱功能、紫外可见检测器的LC220高效液相色谱仪对阿胶中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种主要氨基酸指标成分进行含量测定。
一、方法原理
异硫氰酸苯酯和游离氨基酸可反应生成的PTC-氨基酸衍生物,衍生物在254nm有较强的紫外吸收。衍生后的样品通过色谱柱后各组分得到分离,用紫外检测器检测,用保留时间定性,峰面积外标法定量。
二、主要仪器设备和试剂
a. LC220高效液相色谱仪,配梯度洗脱功能,紫外可见检测器;
b. 万分之一天平;
c. 超声机;
d. 高温防腐石墨加热板;
e. L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品;
f. 异硫氰酸苯酯(PITC):色谱纯;
g. 三乙胺(TEA):色谱纯;
h. 正己烷:色谱纯;
i. 乙腈:色谱纯;
j. 去离子超纯水。
三、实验方法
3.1 衍生试剂配制
准确量取125 μL PITC和1.4 mL TEA,分别用乙腈定容至10 mL,摇匀配制成 0.1 mol/L PITC-乙腈溶液和1 mol/L TEA-乙腈溶液。
3.2 对照品溶液的制备
取L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸对照品适量,精密称定,加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16 mg、丙氨酸70 μg、L-脯氨酸0.12 mg的混合溶液,即得。
3.3 供试品溶液的制备
取阿胶粗粉约0.25g,精密称定,置25 mL量瓶中,加0.1mol/L盐酸溶液20 mL,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,放冷,加0.1 mol/L盐酸溶液至刻度,摇匀。精密量取2 mL,置5 mL安瓿中,加盐酸2 mL, 150℃水解1小时,放冷,移至蒸发皿中,用水10 mL分次洗涤,洗液并入蒸发皿中,蒸干,残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解,转移至25 mL量瓶中,加0.1mol/L盐酸溶液至刻度,摇匀,即得。
3.4 对照品和供试品溶液的衍生化
精密量取对照品溶液和供试品溶液各5 mL,分别置25 mL量瓶中,各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL,1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml,摇匀,室温放置1小时后,加50%乙腈至刻度,摇匀。取10mL,加正己烷10mL,振摇,放置10分钟,取下层溶液,滤过,取续滤液,待上机分析。
3.5 高效液相色谱仪参考条件
色谱柱:C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温40℃;检测波长254 nm;进样量5 μL。流动相A:水:乙腈=20:80;流动相B:0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH6.5):乙腈=93:7。梯度洗脱程序如表1。
表1 高效液相色谱梯度洗脱程序
四、实验结果
4.1 对照品高效液相色谱图
图1对照品高效液相色谱图
4.2 阿胶对照品的重复性
连续注射6针对照品,计算4种氨基酸峰面积重复性,L-羟脯氨酸RSD为0.77%,甘氨酸0.59%,丙氨酸0.61%,脯氨酸0.61%,重复性良好。
图2 对照品溶液重复性
4.3 阿胶供试品高效液相色谱图
图3 供试品高效液相色谱图
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