移液工作站在猪瘟阻断ELISA抗体检测中的应用

猪瘟阻断ELISA抗体检测步骤

猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。

一、实验试剂

1、包被抗原:杆状病毒表达的ASF VP30重组蛋白。

2、酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的抗ASF VP30蛋白单抗。

3、对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清。

4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液

（配制方法：  Na2CO3  0.318g；NaHCO3  0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）

5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS )

（配制方法： pH7.4 PBS  1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）

6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS)

（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA  10 g 现配现用）

6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)

（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml  现配现用）

7、 TMD底物溶液

（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。  底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）

8、终止液(2 mol/1 硫酸)

（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889m去离子水中,室温分装保存）

二、仪器设备

1、酶标仪。

2、恒温孵育箱。

3、洗板机或洗涤瓶。

4、96孔酶标板。

5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S

6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-300

7、4道储液槽60ml 1个 RES-60-4

8、封板膜 FDT-CP30

9、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF

三、试验程序

包被酶标板

用包被缓冲液将ASFV P30重组蛋白稀释至终浓度0.3μg/ml,每孔100μL包被96孔酶标板，37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次，300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。

四、实验步骤（图片仅为实验模拟图）

第一步：

酶标板上对照和样品的分布图,见下图。用移液工作站在每孔加人50μL,的稀释液,在A1、B1孔加人50μL阳性对照血清,在C1、D1孔加入50μL阴性对照血清,在E1、F1孔加人50μL稀释液,其余每孔加入50μL的血清样品,37℃孵育60 min。

样品加样记录表

说明：
P为阳性对照

N为阴性对照

Cm酶标单抗对照孔

空白为待检样品孔

第二步：

弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗5次,洗涤缓冲液300μL/孔。

第三步：

用稀释缓冲液将酶标P30单抗稀释至工作浓度,100μL/孔,37℃育30min。

第四步：

弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗5次,洗涤缓冲液300μL/孔。

第五步：

每孔加人底物溶液,100μL/孔,室温避光作用15min。

第六步：

每孔中加人100μL终止液,终止反应。

第七步：

用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD值,计算阻断率。

阻断率计算方法

阳断率按式(2)~式(4)计算:

BRs=100-(OD450-s X100)÷OD450-Cm ………………(2)

BRNC=100-(OD450-NC X100)÷OD450-Cm  ………………(3)

BRpc=100-(OD450-PCX100)÷OD450-Cm   ………………(4)

式中:

BRs——待检血清样品阻断率;

BRNC——阴性对照血清阻断率;

BRPC——阳性对照血清阻断率;

OD450-s——待检血清样品OD450值;

OD450-NC ——阴性对照血清OD450值;

OD450-PC ——阳性对照血清OD450值;

OD450-Cm——酶标单抗对照OD450值。

五、试验成立条件

阳性对照阻断率>70,且阴性对照阻断率<30,试验结果有效;否则,应重新进行试验。

六、ELISA抗体检测结果判定

在试验成立的前提下,待检样品阻断率>50,则判定为ASFV抗体阳性;待检样品阻断率<50,则判定为ASFV抗体阴性。

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