fluidot自动移液工作站在食品维生素B12测定中的应用

关于fluidot移液工作站在食品维生素B12测定（微生物法

）中的应用

方案摘要：维生素B12又叫钴胺素，是唯一的一种需要胃壁细胞分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的维生素，参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。因此，对食品中维生素B12含量的检测是非常有必要的。本方法利用fluidot自动移液工作站快速测定食品中维生素B12的含量。

方案详情：

一、实验原理

维生素B12是莱士曼氏乳酸杆菌生长所必需的营养素。在一定条件下，莱士曼氏乳酸杆菌的生长与维生素B12的含量成对应关系。根据维生素B12的含量与透光率（或吸光度值）的标准工作曲线，计算出试样中维生素B12的含量。

二、实验准备

1、试剂和材料

①试剂

②菌株

③培养基

④标准品

⑤标准溶液

⑥材料：定量滤纸、锥形瓶等

注：本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定二级水。

2、仪器和设备：

①fluidot自动移液工作站，FDT-M6-12-5000

②天平：感量为0.01g、0.001g和0.00001g

③PH计：精度0.01

④分光光度计

⑤恒温培养箱：36℃±1℃

⑥震荡培养箱：36℃±1℃，震荡速度140r/min~160r/min

⑦压力灭菌器：121℃（0.10～0.12Mpa）；125℃（0.13～0.15Ｍpa）121℃

⑧恒温仪（或水浴锅）：100℃±1℃

⑨离心机：转速≥2000r/min

⑩冰箱：2℃~8℃

⑪涡旋振荡器

⑫均质器

⑬试剂槽

三、实验步骤

1、测试菌液的制备

①将冻干菌株活化后接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36℃±１℃培养18ｈ～24ｈ。再转种2代～3代来增强活力。置2℃～8℃冰箱保存备用。

②菌悬液制备：将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃±1℃培养18ｈ～24ｈ，以 2000r／min离心2min～5min，弃去上清液，加入10ｍＬ9g/L氯化钠溶液，混匀，再离心2min～5min，如前操作，弃去上清液，再加10ｍＬ9g/L氯化钠溶液，混匀。

③测试菌液：吸适量菌悬液于10ｍＬ9g/L氯化钠溶液中，混匀制成测试菌液。用分光光度计，以9g/L氯化钠溶液做空白，于550nm波长下检测测试菌液的透光率，使测试菌液透光率在60％～80％。

样品前处理

①试样制备：固体样品粉碎、研磨，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。所有制备后的试样冷藏保存，一周内测定。

②称一定量的样品（精确至0.0001g，样品中含维生素B12为50ng～100ng）于250ml高压灭菌瓶中，用100ml的提取溶液混匀后，加150ml水，摇匀，置于压力灭菌器中121℃水解10min，冷却后用盐酸溶液（１mol／Ｌ）调ph 至4.5±0.2，转入250ml容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤。移取滤液5 ml，加入20ml～30ml水，用氢氧化钠溶液（1mol／Ｌ）调ph至6.8±0.2，转入100ml容量瓶中，定 容至刻度，作为试样提取液。 必要时进一步调整稀释倍数（用犳表示），使试样提取液中维生素B12的质量浓度在0.01ng／ml～ 0.02ng／ml，偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03mg／ml。

标准溶液的配置

①准备30个10mL的试管，仪器取1个5mL吸头，从试剂槽中吸取无菌水分别加5按表3的量加试管中，丢弃吸头；

②再取一个新吸头，从试剂槽2中吸取无菌水0.0１ｎｇ／ｍＬ标准使用工作液分别按表3的量加试管中，丢弃吸头；

③再取一个新吸头，从试剂槽3中吸取无菌水0.02ｎｇ／ｍＬ标准使用工作液分别按表3的量加试管中，丢弃吸头；

④再取一个新吸头，从试剂槽4中吸取测定用培养基分别按表3的量加试管中，丢弃吸头；

注：以上溶液按一式三份来配置。

待测液的配置

①准备12个10mL的试管，仪器取1个5mL吸头，从试剂槽1中吸取无菌水分别按表4的量加试管中，丢弃吸头；

②再取一个新吸头，从装吸取试样提取液的容器中分别按表4的量加试样提取液于试管中，丢弃吸头；

③再取一个新吸头，从试剂槽4中吸取测定用培养基分别按表4的量加试管中，丢弃吸头；

注：以上溶液按一式三份来配置。

灭菌

在需培养的试管内分别加入一粒玻璃珠，盖上试管帽，121℃灭菌5min（商品培养基按标签说明进行灭菌)

接种

将灭菌后的试管迅速冷却至30℃以下。除标准曲线管中空白S1管外，用移液器分别向上述试管中加入1滴（约50μＬ）测试菌液。

培养

将试管于36℃±1℃培养19ｈ～20ｈ。培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种试管S1内培养液应是澄清的，如果S1管出现浑浊，则测定无效，需重做试验。

测定

①以接种空白管做对照，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2ｈ后重新测定。两次结果透光率差值若小于２％，则取出全部检验管测其透光率。

②用未接种空白试管（S1）作空白，将分光光度计透光率调到100％（或吸光度为０），读出接种空白试管（S2）的读数。再以接种空白试管（S2）为空白，调节透光率为100％（或吸光度为０），依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。

③用涡旋振荡器充分混合每一支试管内培养物（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长550ｎｍ。待读数稳定30ｓ后，读出透光率，每支试管的稳定时间要相同。各标准曲线浓度点３管吸光度值的相对标准偏差应小于15％。如果3支试管吸光度的相对标准偏差大于或等于15％，则舍去该标准曲线浓度点（舍去的标准曲线浓度点数量不得超过一个）。以标准系列管中维生素B12浓度为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线。

④根据待测液的透光率，从标准工作曲线中计算该待测液中维生素B12的浓度，根据稀释因子和称样量计算出试样中维生素B12的含量。透光率超出标准曲线管S3～S10范围的测试值要舍去。

⑤用每支试管的透光率计算每毫升每个编号待测液中维生素B12的浓度，并计算该编号待测液的维生素B12浓度平均值，每支试管测得的浓度不得超过该平均值的15％，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2／3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2／3，重新计算每一个编号的有效试样管中每毫升测定 液中维生素B12含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为ρ。用式（3）计算试样中维生素B12的含量X。

注：绘制标准曲线，既可读取透光率（T%），也可读取吸光度（A）。

分析结果的表述

其它

①在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。

②本方法检出限为0.1μｇ／100ｇ。

经验证比较确认后，可采用检测体积等比例缩小的微生物微量培养法。