【Nature子刊】改进与优化基于NTA的EV单颗粒荧光标记及检测方法

美国塔夫斯大学 (Tufts University) 的研究人员们报道了一种荧光免疫标记单个 EV 用于 NTA-FL 的优化算法，使得基于NTA的单囊泡免疫标记和检测与粒度分布和浓度分析更为精准。该算法可以有效地提高NTA检测结果可信度，为更深入研究 EV 的功能和机制提供了强有力的工具。

在前期研究中，研究人员们发现传统的利用NTA进行EV亚型分析的荧光/散射光比对方法会出现数据偏离的情况。通常情况，荧光 (FM) 曲线所围绕的面积与散射光 (LSM) 曲线所围绕成的面积的比值可以表示EV的纯度。但是这些研究人员们在分析过程中发现，在测试1，2，4中（表1，图1），FM（蓝线)与LSM（红线）的比值大于100%，表明EV纯度大于100%，这显然是不合理的，这种测试结果表明：

1. 荧光检测过程中，可能出现了大量的假信号。

2. NTA 系统的技术限制导致 LSM 无法检测到非常小的 EV 或折射率低的其他颗粒。散射光模式下EV检测不全，有部分EV数据没有检测到，使得LSM面积偏小，从而导致比值大于100%。

3. 研究人员还发现，FM模式在50 nm以下的区域还有明显的信号峰出现，而对比LSM模式，其在50 nm以下信号基本衰减为0，这可能也是造成比值大于100%的原因之一。具体而言，这可能是游离的荧光分子没有充分去除，以及体系中游离的蛋白质被荧光分子标记，造成小尺寸分区中的荧光信号增强。

为了解决这种情况，研究人员们提出了两种评估方法：

第一种方法是传统的计算方法，即计算样本中大于 50  nm的颗粒数量，并比较 FM 和 LSM 中的颗粒数量，得出 FM 与 LSM 之间的比例。（图2b，c）

第二种方法是优化后的计算方法，计算两种方法得到的粒度分布曲线之间的重叠区域，并将该区域与 LSM 中大于 50 纳米的颗粒总数量进行比较，得出重叠区域比例。（图2d）

在研究过程中，研究人员着重强调了他们对颗粒粒径选取的取舍。为了更精确地分析 EV，研究人员将分析范围缩小到 50-200 纳米。之所以选择这个范围，是因为大多数 EV 的尺寸都在这个范围内。此外，LSM对小于 50 纳米的颗粒检测能力有限，而大于 200 纳米的颗粒则可能并非 EV。因此，将分析范围缩小到 50-200 纳米可以有效地排除其他类型的颗粒，提高分析结果的准确性。

图2 基于NTA的免疫标记算法示意图

表2 算法优化后不同样本的荧光面积 (FM) 与散射光面积 (LSM) 比值（SA）

NanoCoulter纳米粒度仪采用库尔特原理，打破了光学原理的局限性，可以精准分析每个过孔颗粒，实现真正意义上的单颗粒检测，对粒径分布广的多分散系样本有更好的测量效果。且不受样本的折射率、吸光度等光学性质影响，数据不拟合，最真实的反应样本状态。