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【求助】GB/T 5009.5(蛋白质的测定 凯氏定氮法)中的蒸馏定氮装置图,我有这个国标,就是没有仪器装置图,查了半天也没查到,现在急用,请各位前辈帮帮忙啊!先谢了!
[size=18px][font=&] 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源,具有不可替代的作用。含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。在检验食品中蛋白质时,通常是先检定出食品中的总氮量,然后乘以蛋白质换算系数,以此得到蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出,至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。[/font][font=&]原理[/font][font=&]向样品中加入浓硫酸和催化剂,充分混匀,然后加热消化分解,样中碳和氢被氧化成二氧化碳和水,其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。[/font][font=&]样品消化[/font][font=&]浓硫酸具有脱水性和氧化性,可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水,蛋白质会分解为氨,然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点,一般情况下,纯硫酸的沸点在340℃左右,但是在添加硫酸钾后,可提高至400℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾,否则会因为温度过高,使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外,还可以指示消化终点的到达,有机物全部消化完全后,溶液呈现清澈的蓝绿色,硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。[/font][font=&]蒸馏[/font][font=&]消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出,影响测定结果,所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐,需要足够的碱液使结合态的氨完全反应并释放出来,这个过程中的氢氧化钠一定要过量,过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀,氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成,可用奈氏试纸法,NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。[/font][font=&]吸收[/font][font=&]加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收,硼酸有吸收氨的作用,又因其呈微弱酸性,不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱,从而造成损失,故一般不超过40 ℃。[/font][font=&]滴定[/font][font=&]待吸收完全后,用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定,滴定液的浓度直接影响结果的准确性,必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色,滴定终点时液体呈灰色。[/font][font=&]注意事项[/font][font=&]①所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制;[/font][font=&]②取样应具有代表性,取样前将样品充分混匀;[/font][font=&]③样品称量放入凯氏烧瓶时,切勿使样品粘附在瓶颈部,避免样品未消化完全而造成氮损失;[/font][font=&]④为了保证使烧瓶壁上的残渣消化完全,在消化过程中要不时地转动凯氏烧瓶;[/font][font=&]⑤消化脂肪或糖含量较高的样品时,易产生大量泡沫,为防止泡沫溢出,消化时应先消化加热并不断摇动,或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂;[/font][font=&]⑥当样品消化液浑浊或未澄清透明时,可先将凯氏烧瓶放冷至室温后,再加入30%的过氧化氢,然后继续加热消化;[/font][font=&]⑦加碱后,漏斗要进行水封,避免因装置漏气造成氨的逸出影响结果的准确性;[/font][font=&]⑧要保证蒸馏装置不能漏气;[/font][font=&]⑨在蒸馏时反应室与外界存在的压力差,蒸汽可将氨带出。故蒸馏时,要保证蒸汽均匀、充足,中间不能停止加热,防止发生倒吸;[/font][font=&]⑩蒸馏前如果加碱后消化液呈蓝色而没有生成氢氧化铜沉淀,说明加入的碱量不足,需要适量补加碱;,蒸馏时为防止水蒸气发生器内液体爆沸,加入几片碎瓷片或大的玻璃珠,玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径,以免玻璃珠进入玻璃管内影响蒸汽均匀、充足的输出;-冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下,防止氨逸出,蒸馏完毕后先将冷凝管下端提离液面,再蒸1min后清洗管口,再移开吸收瓶,最后关掉热源,否则可能发生倒吸。[/font][font=&]常见问题解答[/font][font=&]一、消化过程中容易沾壁怎么办?消化后定氮瓶内有黑色残留物怎么办?[/font][font=&]解答:称样时需要注意切勿使样品粘附在定氮瓶颈部,避免因样品未消化完全而造成结果偏低。消化过程中如果发生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色残留物,可以在消化较完全时摇动定氮瓶,把定氮瓶肚上的黑色物质摇洗下来。摇动的方法是取下小漏斗,戴上防烫手套,手掌紧握瓶颈,向前后侧甩,使瓶内液体呈半旋转半振荡状态,注意控制力度不要让液体溅离瓶口。[/font][font=&]二、硫酸钾的作用是催化剂吗?[/font][font=&]解答:硫酸钾的作用是提高溶液沸点,从而加快有机物分解。[/font][font=&]三、硫酸铜是否是消化终点以及加碱蒸馏时的指示剂?[/font][font=&]解答:硫酸铜的作用有三个,分别为:[/font][font=&]①催化作用:加速有机物的氧化分解。[/font][font=&]②消化完全的指示剂:使液体呈现蓝绿色澄清透明状态。[/font][font=&]③蒸馏时碱性反应的指示剂:产生褐色沉淀。[/font][font=&]四、混合指示剂必须临用时混合吗?[/font][font=&]解答:混合指示剂必须临用时混合。[/font][font=&]五、请问蒸馏的时取下锥形瓶,需要用洗瓶冲洗吗?不冲洗会有误差吗?[/font][font=&]解答:需要冲洗冷凝管下端以防止产生结果误差。蒸馏后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,然后取下蒸馏液接收瓶。[/font][font=&]六、蒸馏仪器的检漏如何操作?[/font][font=&]解答:可以将蒸馏装置连接好后,在接口以及瓶塞等可能漏气的地方滴加少量水,打开电炉加热,观察有无气泡产生。[/font][font=&]七、硼酸可以多加吗?[/font][font=&]解答:不可以。按国标的要求正确操作,10mL硼酸足够。[/font][font=&]八、滴定时消耗了很多盐酸溶液,能否换浓度高的盐酸溶液滴定?[/font][font=&]解答:不能更改国标给出的滴定液浓度。蛋白质含量较高的样品可以适当减少称样量,或合理范围内减少吸取消化液的体积V3。[/font][font=&]九、空白消耗标准滴定液的体积指的是什么?[/font][font=&]解答:试剂空白实验消耗的标准滴定溶液的体积就是空白体积。[/font][font=&]十、同时有两种蛋白怎么换算?[/font][font=&]解答:同时含有多种蛋白质,且折算系数不相同时可以按复合配方食品换算蛋白质系数。[/font][font=&]结语:凯氏定氮法经典、准确,适用于食品中蛋白质的测定。但是因样品中一般会含有一些非蛋白质的含氮化合物,所以凯氏定氮法测定结果为样品中粗蛋白质含量。然而,此法实际上测的不是蛋白质含量,而是通过测氮含量来推算出样品中蛋白质的含量。在凯氏定氮法中消化操作的条件是产生误差的主要原因,因此要格外注意。在实际的生产实验中,每一步应该严格按照标准的规定来进行操作。本文为笔者日常工作实验总结所得,望对实验者有些许帮助。[/font][/size]
[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体]在蛋白质研究领域,稳定细胞系的应用已成为生产高质量结构生物学蛋白质的关键手段。随着技术的不断进步,稳定细胞系的生成与筛选方法得到了显著改进,从而推动了蛋白质生产的高效化与精准化。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]细胞系的建立和应用[/font][font=宋体][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系[/font][/font][/b][font=宋体]因其稳定的蛋白表达和适当的翻译后修饰而被广泛用于结构生物学研究。这些细胞系能有效地生产具有复杂糖基化模式的蛋白质,这对于确保蛋白质的功能和稳定性至关重要。糖基化缺陷细胞系通过特定的基因改造,能够分泌脱糖基化糖蛋白,为蛋白质生产提供了更加纯净的原料。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系的生成[/font][/b][font=宋体][font=宋体]传统的稳定细胞系生成技术如瞬时转染,虽然方法简便,但存在整合频率低、转基因沉默等问题。为了克服这些困难,研究者们开发出了一系列新技术,如细胞分选技术、位点特异性重组(如[/font][font=Calibri]FLP/FRT[/font][font=宋体]系统)、转座子系统(如[/font][font=Calibri]piggyBac[/font][font=宋体])、慢病毒系统以及噬菌体整合酶等,提高了稳定细胞系的生成效率和稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]序列特异性基因组工程也为稳定细胞系的生成提供了新的思路。通过敲除或修饰特定的基因,研究者们能够实现对细胞功能的精准调控,从而优化蛋白质生产的效率和纯度。例如,一种同时缺乏[/font][font=Calibri]GnTI[/font][font=宋体]和谷氨酰胺合成酶([/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体])活性的[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系被成功开发出来,为高效筛选具有[/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体]标记的稳定细胞系提供了有力工具。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系与瞬时转染的比较[/font][/b][font=宋体]稳定细胞系相较于瞬时转染具有多个优点,包括能够进行大规模生产和保持高水平的蛋白表达稳定性。尽管瞬时转染在某些情况下能快速产生大量蛋白,但其表达水平和重复性通常不如稳定细胞系。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]展望[/font][/b][font=宋体]近年来,利用稳定细胞系高效生产结构生物学蛋白质已成为研究的热点和趋势。通过引入新技术、优化筛选方法和改进整合系统,不仅能够提高蛋白质生产的效率和纯度,还能够为结构生物学研究提供更加精准、可靠的实验工具。随着基因编辑和细胞工程技术的进步,预计在未来,通过精确的基因操作能够更有效地创建和利用稳定细胞系。这些技术的进步将促进结构生物学和药物开发中蛋白质的高效和可持续生产。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]本文由义翘神州进行整理,同时提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][u][font=宋体][color=#0000ff]稳定细胞系构建服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体],详情可点击了解![/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献:[/font][font=Calibri]Büssow K. Stable mammalian producer cell lines for structural biology. [/font][i][font=Calibri]Curr Opin Struct Biol[/font][/i][font=Calibri]. 2015 32:81-90. doi:10.1016/j.sbi.2015.03.002[/font]