精子形态分析

棱镜泰克生物Sperm-Cyto流式精子分析仪作为全国首台套，2023年11月获得四川省食品药品监督管理局批准的二类医疗器械注册证（注册证编号：川械注准20232220389），并成为全国第一台以流式细胞术为原理专用于“男科”实验室精子检测仪器，实现对精子功能的全面检测，弥补传统精液常规无法检测的男性不育指标，解决传统精液检测方法偏形态、无法评估精子功能的痛点。更多的精子检测产品即将同步上市，让我们的目标客户有更多期待。流式精子分析仪区别于传统检验科流式平台：1.使用独有的CLS液流控制技术，有效避免了精子样本液流堵管以及检测试剂染料残留的传统流式检测顽疾； 2. 全面支持精子功能检测，提供满足临床及科研对于精子DNA完整性、诱发顶体反应、顶体完整性、精子活性氧、精子线粒体、精子凋亡等的各项功能的检测，不断提升对精子评价的广度和深度；3. 采用深度学习算法，软件整合了精子DNA完整性、诱发顶体反应、顶体完整性、精子活性氧等自动分析功能，实时计算检测结果并且显示，实时预览报告，支持一键式分析、审核及报告打印或LIS系统双向通讯。流式精子分析仪检测方法学优势流式精子分析仪（SCSA法）检测快速，检测速度每分钟高达50000个精子以上，更具有临床统计学意义。软件自动分析，结果无主观偏倚，可重复性强；显微镜（SCD法）人工镜检计数，每次检测200个精子，检测人员工作量大，且存在主观偏倚、重复性差；流式精子功能检测项目临床意义

不孕不育影响了全球约6-8千万夫妇。男性因素导致了约半数的不孕不育病症，精子质量差的是主要问题。因此，深入了解精子质量有助于男性不育症的预防和对应治疗。以往研究表明，多种化学元素（如Zn，Cu，Se等）在精液中发挥着重要的生理功能。相关的元素分析主要集中在精液或精浆上，而很少着眼于精子细胞。此外，常规的批量分析无法提供单个细胞的特定元素信息，模糊了细胞之间的异质性。单细胞电感耦合等离子体质谱法（scICP-MS）作为一种成熟的技术，能够填补这一信息空白。通过采用配备飞行时间分析器的ICP-TOF-MS，可以高通量且高灵敏地检测单个细胞的全谱元素含量（微信公共号‘单细胞分析的丝滑IMAX体验: icpTOF 以多元素指纹量化海藻细胞与纳米颗粒间相互作用为例’）。 近期中科院生态环境研究中心阴永光研究员与中科院高能物理研究所王萌副研究员以及同济医院靳镭教授合作，使用scICP-TOF-MS（仪器型号：TOFWERK icpTOF 2R）实现了单个精子细胞的高通量全元素检测.icpTOF实验方法 研究人员首先通过离心分离细胞。再使用不含磷盐的有机缓冲液和多聚甲醛等渗固定剂清洗和固定细胞。之后再用纯水进一步清洗细胞，以去除干扰离子（主要是Na和Cl）。经处理的精子细胞在显微镜下形态完整，无基质干扰，因此提高了信噪比，也避免了ICP-TOF-MS仪器检测器饱和。icpTOF结果与讨论 在scICP-TOF-MS中，由于可以实现同时的多元素检测，研究人员将内源性元素作为细胞信号，同时分析其他信息，如外源性元素信息。磷元素(31P)在精子细胞中含量丰富，可作为细胞信号指示元素。在scICP-TOF-MS分析中，细胞信号和背景信号的P强度分布均可明确区分（图2A和图2B）。高时间分辨率的单细胞检测中，ICP-TOF-MS的P的信号峰和基线相比有明显且相对固定的信噪比。（编者注：如图1所示，icpTOF 2R的强大质量分辨率可更好区分干扰信号，有利于P元素的准确检测。在icpTOF全谱测量，没有为低质量数P元素灵敏度专门优化的大前提下，仍能取得较好的信噪比）。图1 icpTOF 2R ICP-TOF-MS可区分P信号和其他干扰信号。 该实验中，结合高时间分辨的连续单细胞实验结果，作者推断假阳性的信号大多来自细胞碎片，主要基于下列实验结果：1， 峰信号的元素组成特征更符合细胞碎片的特征，且有P信号存在时检测到的其他（内源性）元素质量显著高于没有P信号时的相应元素质量（图2C）；2，流式细胞仪也证实精子细胞悬浮液中存在相当数量的细胞碎片。编者注：另外还可能有套实验数据可以用来辅助证明，细胞碎片的瞬时事件时长应该显著小于完整单细胞。TOFWERK icpTOF S2的超高时间分辨率在后续实验中可以用来验证这一点。通过计算细胞碎片率，相对于高质量精子，研究发现低质量精子样品中含更多的细胞碎片（图2D），这可能跟低质量精子细胞的形态异常等相关。图2 （A）scICP-TOF-MS测得的P信号分布图；（B）单细胞进样条件下，scICP-TOF-MS测得的实时P信号；（C）有P信号和无P信号同时检测到的Zn质量；（D）高质量和低质量精子细胞中的细胞碎片比例 细胞中元素的含量普遍表现出细胞异质性。该研究使用scICP-TOF-MS揭示了细胞中不同元素的异质性差异。结果表明，大多数元素表现出较高的异质性，而细胞的大量元素如P、Zn含量稳定，异质性则较低（图3A）。不同元素之间异质性的差异进一步凸显了多元素同时检测的重要性。 基于数以千计的单细胞事件，研究人员使用降维分析和分层聚类来提取每个样本中关键信息。降维分析的可视化展示直观地展示了多种元素在单细胞中分布规律或生理功能的相似性（图3B）。例如P、Zn、Cu在精子细胞中含量很高，是基本的组成元素，因此相似性很高。而蓝圈中的元素大多没有生理功能。聚类分析也为这些相似性提供了客观性证据（图3C）。图3 （A）异质性系数热图；（B）元素相关性降维分析投影图；（C）元素相关性的分层聚类图icpTOF总结这是第一份报告了使用scICP-TOF-MS在单细胞水平对动物细胞进行多元素分析的研究。该分析方法利于更好地了解细胞中元素分布的规律，以及细胞性质和元素分布之间的关联。参考文献原文：Tian et al., Single-cell multi-element analysis reveals element distribution pattern in human sperm, Chemical communications, 2023, DOI: 10.1039/d3cc01575k作者团队简介：阴永光，中国科学院生态环境研究中心研究员、博士生导师。主要研究方向为有毒金属的形态分析与环境转化。王萌，中国科学院高能物理研究所副研究员。现主要开展基于质谱技术的单细胞分析和生物成像方法及应用研究。靳镭，华中科技大学同济医院附属同济医院生殖医学专科主任，二级教授，主任医师，博士生导师。主要擅长生殖医学、男女性不孕症等。

1.元素形态 　　元素的形态是指某一元素以不同的同位素组成、不同的电子组态或价态以及不同的分子结构等存在的特定形式。元素形态又分为物理形态和化学形态，其中物理形态是指元素在样品中的物理状态如溶解态、胶体和颗粒状等 化学形态是指元素以某种离子或分子的形式存在，其中包括元素的价态、结合态、聚合态及其结构等。一般意义上所说的元素形态泛指化学形态，元素形态不同于元素价态，同一元素的相同价态可能有多种形态，如价态为五的砷元素，其元素形态可分为无机态和多种有机态的砷形态。不同元素的主要常见形态如表1所示： 表1 不同元素的主要常见形态 元素名称 元素形态 As 三价无机砷（As(III)），五价无机砷（As(V)），一甲基砷（MMA(V)）, 二甲基砷（DMA(V)）,砷甜菜碱（AsB）, 砷胆碱（AsC）,砷糖（AsS）等 Hg 无机汞（Hg（II））, 一甲基汞（MeHg（I）），二甲基汞（(Me)2Hg） Cr 三价铬（Cr（III））, 六价铬（Cr（VI）） Se 四价硒（Se（IV）），六价硒（Se(VI)），硒代胱氨酸(SeCys)，硒代蛋氨酸(SeMet)，硒多糖，硒多肽，硒蛋白等 Pb 二价铅（Pb（II））, 三甲基铅（TriML）, 四乙基铅（TetrEL）等 Sn 二丁基锡（DBT）, 三丁基锡（TBT）等 　　元素的不同存在形态决定了其在环境和生命过程中表现出不同的行为 不同的元素形态由于具有不同的物理化学性质和生物活性，在环境和生命科学领域发挥着不同的作用。元素总量或者浓度的相关信息已经不能满足环境和生命科学研究的需要，有时候甚至会给出一些错误的信息。 　　甲基汞的毒性要远高于无机汞，并且具有极强的生物亲和力，同时无机汞易于在生物体内富集并转化为甲基汞。人们首次认识到甲基汞的危害是在1955年，在日本的Minamata，因孕妇食用遭受甲基汞污染的鱼类，造成22名新生儿严重的脑损伤。在1971-1972年，伊拉克发生了大面积的甲基汞中毒事件，其原因在于当地人食用了经过甲基汞处理过的小麦做成的面粉。 　　Cr(III)是维持生物体内葡萄糖平衡以及脂肪蛋白质代谢的必需元素之一，而Cr(VI)却对生物体具有很大的毒性和致癌作用,原因在于其更强的氧化性和化学活性及迁移性 砷是一种有毒元素，但是不同形态砷的毒性却差别比较大，一般无机态砷毒性比较大，三价砷的毒性要大于五价砷 而有机态的砷中，甲基砷的毒性要强于其他的有机态砷，砷甜菜碱、砷胆碱和砷糖等则基本上没有毒性 对汞、锡和铅等重金属元素来说，有机态的化合物的毒性要远远高于无机态。作为人体必须的元素，铁仅仅是在二价时才能被生物体吸收和利用，食品中的总铁并不能代表可吸收利用的有效铁 硒是人体必需的元素，但是吸收过量时会导致硒中毒，不同形态硒的生物可利用性和毒性也差别较大 铝的毒性也和其形态密切相关，自由态的铝离子、水化羟基化合物Al(OH)2+和Al(OH)2+等是致毒形态，多核羟基铝也具有一定的毒性，而铝的氟配合物以及有机态配合物则基本无毒。 　　根据传统分析方法所提供的元素总量的信息已经不能对某一元素的毒性、生物效应以及对环境的影响做出科学的评价，为此，分析工作者必须提供元素的不同存在形态的相关信息。元素形态具有多样性、易变性、迁移性等不同于常规分析对象的特点，因此其分析方法也成为一个崭新的研究领域，即“元素形态分析”。 　　2.元素形态分析 　　元素形态分析是分析科学领域中一个极其重要的研究方向，IUPAC将其定义为定量测定样品中一个或多个化学形态的过程。Lobinski将其定义为确定某一元素在样品中不同化学形态分布的过程 Caroli指出，形态分析为识别和定量检测对人体健康和环境有危害的不同形态的无机分析物 Hieftje则将获得相关目标分析物原子的氧化态、键合特征、电荷态及原子缔合体的过程定义为形态分析 Welz则认为所谓元素形态分析是指测定特定条件下不同化合物的氧化态或可溶态的过程。曾有人根据Tessier连续萃取法将土壤中元素形态分为可交换态、碳酸盐结合态、铁-锰氧化物结合态、有机物结合态和残渣态等五种，但这并不是严格意义上的形态分析，这一萃取过程并不能提供涉及分子结构和电荷状态的元素形态的详细信息。 　　在20世纪70年代末至80年代初，Van Loon和Suzuki分别在权威期刊Anal. Chem.和Anal. Biochem.上发表了元素形态分析领域的开创性的工作，将广大的分析工作者的研究重点转移至元素形态分析技术的开发上来。经过二十多年的发展，元素形态分析已经成为分析科学领域的一个重要分支，随着这一技术的不断发展，已经为环境科学、生命科学、临床医学、营养学、毒理学、农业科学等领域提供了越来越多的有用信息。 　　3.元素形态分析的技术特点 　　元素形态分析技术主要由样品采集、样品制备、分离/富集、定性/定量、分析报告等五部分组成。在整个形态分析过程中，样品制备过程是形态分析的关键环节，需要注意保持待测元素形态，同时避免污染，这使得样品制备过程较常规总量分析更加复杂和困难。因此，对操作人员提出了更高的要求，同时延长了前处理时间。此外，由于元素的某一形态，仅仅是元素总量的一部分，甚至是极少的一部分，因此对分析方法的灵敏度提出了更高的要求，只有高灵敏的检测技术才能满足元素形态分析的要求。此外，用于元素形态分析的标准物质和标准参考物还需要倚赖进口，在一定程度上影响了形态分析技术的推广。 　　4.元素形态分析方法 　　由于一种元素存在几种甚至是几十种元素形态，因此分析方法已不同于传统的总量分析。在前处理方法上需要保持元素的现有形态，因此也不能沿用传统的酸消解方法 在测定方法上，形态分析也远不同于传统的总量分析，对方法的检出能力和稳定性提出了更高的要求。 　　早期的形态分析方法一般采用差减法进行测定，通过控制某些测量条件，实现总量和某些元素形态的测量，然后通过差减的方法得到其它元素形态的含量信息。如通过测量总砷和三价砷，二者相减即可得到五价砷的浓度 如通过四价硒和总硒的测量，即可测得六价硒的含量。差减法相对比较简单，整个分析过程对实验条件的要求不高，但是该方法仅仅适用于元素形态较少的条件，且操作较为繁琐。 　　元素形态分析的通用方法是先对元素的各种形态/组态进行有效分离，然后再进行检测。近年来，人们在追求元素形态分析方法的高灵敏度、高选择性的同时，也一直在致力于提高分析过程的效率，缩短分析过程的时间，力图实现整个分析过程的自动化。传统的元素形态分析方法将元素形态的分离与测定分别进行，使得操作过程变得比较繁琐，同时在操作过程中可能会造成样品的损失以及元素形态的变化，对最终的测定结果产生比较大的影响。联用技术将高效的分离技术与高灵敏的检测技术有机结合，元素形态经过分离后通过在线“接口”直接进入检测器进行检测，这样灵敏度、准确度和分析过程的效率都得到很大提高。　　5.HPLC-ICPMS联用 　　自1983年第一台商品仪器问世以来，ICP-MS经过近20多年的发展，已经成为各行业用于元素分析和同位素分析最有力工具，具有极低的检出限(10-15～10-12量级)和极宽的线性范围(8～9个数量级)以及极强的多元素快速检测能力。由于检测的是质量/电荷比(m/z)，不存在光谱分析中的光谱干扰问题，但存在同量异位素、多原子分子离子以及多电荷离子的干扰问题，如40Ar35Cl干扰75As、40Ar40Ar干扰80Se、36Ar18O干扰54Fe的测定。 　　HPLC-ICP-MS联用技术已经成为分析化学中最热门的研究领域之一，已经被认为是目前最有效和最有发展前景的形态分析技术，已经得到了较为广泛的应用。但是ICP-MS对色谱分离中所普遍使用的高盐组分和高含量有机组分，如甲醇、乙腈等承受能力有限，大大限制了其在与色谱联用中的应用。此外，ICP-MS昂贵的价格、对操作人员的较高要求以及极高的运行和维护成本限制了ICP-MS在元素形态分析领域的广泛应用。中国经济相对不发达的现状，决定了HPLC-ICP-MS不可能在中国进行普及和推广。 　　6.HPLC-VG-AFS联用 　　原子荧光光谱仪是具有中国特色的分析仪器，它具有分析灵敏度高、线性范围宽、仪器结构简单、成本低廉、易于维护、光谱干扰及化学干扰少等独特优点。对于As、Hg、Se、Pb等元素的特征谱线均处于原子荧光最佳的检测波长范围，在采用了高效的蒸气发生进样技术后，具有其他分析手段无可比拟的检出能力，可以获得与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)相当的检出限和灵敏度。VG-AFS与色谱的联用技术的研究已经开展30多年，但由于缺乏理想的商品化仪器，一直没有太大的发展。随着近年来国内原子荧光技术的不断发展和完善，在各项性能上都得到了很大提高，已经具备了与色谱联用的条件。如果将原子荧光的高效检出能力与色谱的高效分离技术完美结合，就可以实现As、Hg、Se等元素的形态分析。 　　原子荧光采用的蒸气发生进样技术能够使待测组分与基体有效分离，因此具有极强的耐高盐组分和有机组分的能力，能够和任意的色谱分离条件相匹配。此外原子荧光还具有成本低廉和操作简单等优点，使得HPLC-VG-AFS联用技术应用于元素形态分析具有极大的发展前景，易于在各个行业推广和使用。 　　7.元素形态分析的必要性 　　砷作为常见的有毒有害元素，一直倍受人们关注。砷摄入过多可引起急性中毒，长期低剂量暴露可引起慢性砷中毒，诱发各种皮肤病并可导致肝肾功能受损，甚至导致癌症。砷的毒性与砷的赋存形态密切相关,不同形态的砷毒性相差甚远。在主要的砷化物中,亚砷酸盐和砷酸盐毒性大,而MMA和DMA毒性小, AsB和AsC则被认为没有毒性。亚砷酸盐、砷酸盐、MMA、DMA、AsB、AsC和AsS对实验小鼠的半数致死量(LD50)分别为14、20、700~1800、700~2600、10000、6500、8000mg/kg。GB 2762-2005《食品中污染物限量》中规定贝类及虾蟹类水产品(鲜重)的无机砷限量标准为0.5mg/Kg, 干重的限量标准为1 mg/Kg,。GB/T5009.11-2003提供了食品中总砷和无机砷的测量方法，为有毒的无机砷检测提供了技术手段。 　　近年来, 国内质检机构一直依据GB/T5009.11-2003来检测食品中的无机砷。继广西检出大量紫菜中无机砷超标以来, 国家工商局又报道了44.9%的紫菜、海带中无机砷超标,甚至引发了紫菜、海带能否安全食用的讨论。紫菜属海生植物型食品,其中砷主要是以AsS的形式存在,几乎不含无机砷。2004年在香港媒体上报道多次的鱼罐头事件，香港消费者委员会测试了市面上的48款吞拿鱼、沙甸鱼等鱼类罐头，发现当中的17种砷含量超标，引起规模超过5亿元的内地鱼罐头产业近年来一直不景气。 　　实际情况是，国内绝大多数海产品并未超标，只是目前的检测方法存在问题。我们以海带、紫菜类植物性海产品为例，加以详细说明。植物性海产品中,砷主要以砷糖(AsS)的形式存在，此外还含有少量的二甲基砷酸(DMA)。如果依照GB5009.11-2003的样品前处理方法，采用6mol/L的盐酸进行提取，则植物性海产品中的AsS会部分分解，转化为DMA，如图1所示。标准中所采用的原子荧光检测方法，是以蒸气发生化学反应作为基础的，其检测过程如下： 　　(1) 样品中的五价砷在进样前，首先被还原剂还原成三价无机砷 　　(2) 然后在进样后和KBH4反应，生成AsH3和H2 　　(3) AsH3经过气液分离后，在氩气和氢气的携带下，进入原子化器 　　(4) AsH3最终在Ar-H火焰中解离，生成砷原子。 　　(5) 砷原子受到特征谱线的辐照，其外层电子受到激发，跃迁至较高能级，在其返回至基态时，发出共振荧光 　　(6) 共振荧光被检测器所接收，经过前置放大后，转化为电信号，输出至控制软件中，进行定量计算。 　　由于DMA也会和KBH4反应，生成气态的As(CH3)2H, 而As(CH3)2H也会在Ar-H火焰中解离，生成砷原子，所以GB5009.11-2003的样品前处理方法造成的AsS分解所产生的DMA以及样品中原有的DMA均会被以无机砷的形式检出，得到“假阳性”的分析结果。因此，检出的大规模海带、紫菜中无机砷超标的结果是错误的，究其原因，主要在于其前处理方法使得以无毒有机砷存在的AsS被当成无机砷被检出。 　　对于GB5009.11-2003的标准方法，存在两个问题： 　　(1)样品前处理问题 　　6mol/L的盐酸使得紫菜、海带类样品中的AsS部分分解，其方法值得商榷。 　　(2) 检测方法的问题 　　由于采用蒸气发生-原子荧光检测方法，样品中的有机砷，如DMA和MMA也会生成氢化物，被误认为是无机砷被检出。因此，该方法对无机砷检测而言，不是特异性检测方法，部分有机砷形态也会同时干扰测量，造成结果偏高的现象。 　　因此，针对上述两个问题，只能采用高效液相色谱-原子荧光联用的方式加以解决，将所测量的砷形态经过色谱分离后，再检测，就不会存在上述问题。 　　北京金索坤公司生产的形态分析原子荧光光谱仪，是金索坤公司多年技术研究成果，专门针对元素形态分析需求设计的高端产品，内置了在线消解装置，配备了液相泵，并采用索坤的连续进样技术和液相泵无缝对接，实现对柱后流出液实时监测，连续采集数据，大大提高了形态分析原子荧光光谱仪的准确度。 　　不仅是形态分析原子荧光光谱仪，北京金索坤公司的SK系列原子荧光光谱仪还有预留联用接口，可与任何型号的液相色谱仪无缝对接，进行形态分析，更是以其卓越的稳定性和可以检测多种元素深受广大用户的青睐，索坤公司成功研制出新一代的原子荧光，其在保持了传统原子荧光设备的技术优点外，更具备了三大主要特点： 　　▲超高重复性指标 　　▲多达18种的测试元素 　　▲简便快捷的操作 　　实现以上三大特点，归功于2大核心技术彻底由理论化为生产，两大核心技术： 　　2010年11月通告的发明专利《连续流动进样氢化物发生系统》(专利号：ZL.200610113008.4) 　　《小火焰法原子化技术在无色散原子荧光上的应用》(专利号：03134241.8) 　　索坤公司经过了无数次的试验和研发改进，以及配套的十多个实用新型专利，才得以将原子荧光技术-中国为数不多的具有自主知识产权的分析仪器-更新换代，且填补了国际空白，为国家的仪器发展事业增砖添瓦! 　　应用了换代技术的产品性能，重复性将比现在的优越一倍，具体的数据正在提交权威机构检测中。索坤公司的新世代原子荧光光谱仪，分为三大产品系列： 　　▲企业系列---为企业量身定做，超高性价比： 　　SK-830 │SK-2003A │SK-2003AZ 　　▲质检系列---更多的可检测元素及强大功能： 　　SK-盛析│SK-锐析│SK-2002B│SK-2003│SK-2003AZ 　　▲科研系列---全面的重金属检测及形态分析： 　　SK-博析│ SK-典越