定氮索氏分子仪

生物结构和功能之间的联系是生命科学研究的关键，然而对这个领域的认识目前仍有很多空白。LUMICKS 是总部位于荷兰的生命科学仪器供应商，研发和生产动态单分子和细胞亲合力分析仪器，让研发人员能够在分子和细胞水平上建立结构和功能之间前所未有的桥梁。 LUMICKS 的产品在生物相互作用过程中施加和测量作用力，实现对分子和细胞的研究，从而能够对潜在的生物机制进行详细的实时分析。LUMICKS主要有两款产品，分别是C-Trap® 动态单分子显微镜和z-Movi® 细胞复合亲合力分析仪，目前众多世界顶尖大学研究所均为 LUMICKS的技术产品的用户，如哈佛大学，牛津大学，清华大学等。2020 年， LUMICKS 在北京设立了亚太区办公室 （卢米科思贸易（北京）有限公司）以服务于亚洲的客户。单分子&动态 观察生物分子机制的全幅图景现代的生物研究通常涉及多种实验技术与方法手段，想了解一个生物分子机制的全幅图景，我们既需要能够分析单个分子，也需要了解分子的动态过程。为什么单分子如此重要？首先单分子观察是对一个分子最直观的分析，眼见为实，这也是许多科学技术一直追求观察更小的单元的原因。其次，单分子技术允许科学家了解单个分子的性质，并非是一个群体的结果。众多技术，例如凝胶电泳、表面等离子共振等，提供的都是万千分子的平均读数，常常不能体现分子的多态性能。为什么我们需要观察动态过程？生物过程本身是动态发展的，只有了解生物分子的行为，才能够理解它们的机制，也才能够为制药、治疗等目标提供指导。结构生物学的方法能够精确到生物分子中的每个原子，然而每个结构都是一个静止的状态，因而目前很多结构生物学家们也在发展能够将静态结构与动态过程结合的方法。C- Trap 动态单分子显微镜填补了这一空白，既能够观察单分子尺度的生物分子，又可以实时观察DNA与蛋白互作、蛋白构象等动态过程。此外，C-Trap的光镊技术允许控制、操作单个 DNA、蛋白、细胞骨架等分子，在微米、纳米尺度下触摸、移动、控制生物分子，为研究人员带来前所未有的体验和结果。C-Trap动态单分子显微镜在动态单分子领域，LUMICKS的C-Trap 是行业首家商业化仪器。相较于其他解决方案，C-Trap 提供业内第一的测量精度和稳定性，真正实现对单分子过程的动态实时观察，高度集成易用的软件使得任何研究人员都可以操作，从样品制备到实验数据分析全流程支持帮助高效产出成果，以及来自全球工程师优质的售后服务。目前 C-Trap 仪器主要在高校的前沿研究中以及生物制药公司的研发中使用，相较于欧美，在中国的C-Trap 使用刚刚起步，未来将会逐步占领市场，成为生物实验室的必备仪器。C-Trap 动态单分子显微镜主要应用在DNA 结合蛋白、细胞骨架与分子马达活性、蛋白质折叠结构变化、细胞力学、生物相变与大分子相分离等领域。尤其在DNA的分子研究领域拥有非常多的应用：DNA 修复，基因编辑，DNA 转录，核小体结构功能等。客户发表在CNS杂志上的应用案例包括DNA 基因编辑过程中 cas9 蛋白与DNA 结合位点在靶、脱靶受哪些因素影响，DNA 损伤修复过程中 Rad 51 蛋白如何与其他蛋白协作，DNA 解旋酶在DNA 上的移动、解旋以及与其他蛋白的互动等等。由于 C-Trap 在生物领域广泛的应用，尤其适合多个研究室作为平台共享设备。免疫细胞治疗领域 复合亲合力测量正在受到瞩目过去的十几年里免疫细胞疗法极大地加速了临床肿瘤治疗的进展，但过继性细胞治疗的效果仍面临着很多挑战。尽管付出了巨大的资源和成本，非常多CAR-T研发团队的临床试验都以失败告终：接受免疫治疗的癌症患者中有很多对药物没有反应或者出现不良反应。这是由于免疫系统与癌细胞的动态环境本身非常复杂，因而众多体外检测方法并不能准确预测体内（临床）疗效。传统衡量免疫细胞效果的方法有很多种。分子水平上，如在研究TCR，CAR受体识别肿瘤表面抗原的特异性时，通常采用的表面等离子共振（SPR）或MHC四聚体（MHC Tetramer）等技术，优化筛选出与靶点亲和力（affinity）最佳的TCR/CAR设计。除此以外，也可以通过体外细胞实验，如细胞杀伤或细胞因子分泌检测去评估免疫细胞的激活及特异性杀伤能力。然而，这些体外实验数据一致性较低，需要更好的生物参数或者assay去预测体内及最终临床结果。什么是细胞复合亲合力（cell avidity）？它阐明了细胞间总的结合强度，这包括了：共受体结合、T 细胞受体（TCR）聚集、细胞粘附蛋白，甚至是结合的方向和分子键的价态。它揭示了一个细胞与另一个细胞之间的复杂的相互作用，而并不仅仅局限于一个蛋白受体与另一个蛋白抗体之间。因而细胞复合亲合力提供了更完整的、更具有生理学相关性的信息，反映了免疫细胞与肿瘤细胞之间更真实的相互作用，从而对免疫治疗期间的细胞响应和效果进行更准确的预测。在免疫细胞治疗领域，特别是CAR-T研发中，复合亲合力测量正在受到瞩目。2022年4月哈佛医学院发表在 《Nature》上的论文 “CAR T cell killing requires the IFNγR pathway in solid but not liquid tumours” 指出“亲合力逃逸” （avidity escape）是实体瘤用来避免 CAR T 细胞杀伤的一种抗性机制，因而对于细胞复合亲合力的测量能够预测 CAR T 对于实体瘤的临床治疗效果。z-Movi 细胞复合亲合力 (Cell avidity) 分析仪，是免疫治疗细胞复合亲合力领域排名第一也是唯一的产品。z-Movi 提供了一套完整的实验解决方案，专注细胞治疗领域，简化免疫细胞筛选流程，一键测量细胞间的复合亲合力。从而帮助研究人员加速细胞治疗产品的筛选和药物开发，更准确高效地筛选出优秀的免疫细胞。z-Movi 细胞复合亲合力检测仪z-Movi 的应用领域主要包括CAR-T, TCR-T, NK/CAR-NK及Cell engager免疫疗法的研发。在CAR-T研发时，通过检测cell avidity，优化CAR的设计，可以降低脱靶效应等不良反应，提高T细胞功能。至于TCR-T，相比affinity，cell avidity与T细胞功能有更好的相关性，借助z-Movi评估不同突变TCR的功能。在NK/CAR-NK研发中，cell avidity也能够用来评估NK细胞的功能及CAR的设计，筛选合适的Donor NK。最后，通过检测不同双特异性抗体与效应细胞靶细胞的cell avidity，研发者能够更好地了解cell engager在细胞相互作用中的功效。未来，我们也将与更多科研院所合作，拓展z-Movi的应用，如树突细胞（Dendritic cell），巨噬细胞（macrophage）等。基于独一无二的测量和优秀的产品设计，z-Movi 已在一众生物制药公司中大放异彩，将来，z-Movi 也必将成为细胞免疫治疗实验室与研发团队中的必备设备。本文作者：王磊博士，LUMICKS 亚太区产品应用专家于晨露博士，LUMICKS 亚太区市场负责人本文为LUMICKS供稿。如有技术干货、科研成果、仪器使用心得、生命科学领域热点事件观点等内容，欢迎相关行业朋友投稿。投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn

p 　　 span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 作为人类疾病的主要病原体之一，病毒结构简单，可作为某些遗传性疾病治疗、肿瘤治疗、基因疫苗等药物研发的基因工程载体 此外，病毒基因简单，对病毒基因进行研究可揭开生物界细胞基因调控和表达的许多未解之谜。可以说，病毒研究对人类社会有着广泛而重要的意义，应用覆盖生物医药、疾控、农业、畜牧业等领域。那么做病毒研究的一般工作流程是怎样的呢?都需要用到哪些高精尖的科学仪器呢? /span /p p span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 　　近日，仪器信息网来到中国科学院武汉病毒研究所公共技术服务中心(以下简称“公共技术服务中心”)，就以上问题采访了公共技术服务中心高级工程师高丁博士。 /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/3b1bca23-d97b-4cf2-b2b7-411799af38ac.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 中科院武汉病毒所公共技术服务中心高级工程师 高丁 /strong /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 特色的分子影像技术平台 /strong /span /p p 　　据高丁博士介绍，分子影像是贯穿病毒研究工作的主线。“比如病毒与宿主细胞之间的相互作用，还有病毒本身的形态、结构分析等，在分子生物学基础上，每一步实验最后都要由显微成像技术来进行验证。” /p p 　　目前，公共技术服务中心具备从高分辨率显微成像一直到活体动物成像的技术平台。包括： /p p 　　 span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 光学显微成像系统： /span 超高分辨率荧光显微镜、双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜、双光子超分辨点扫描共聚焦显微镜 /p p 　　 span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 组织切片成像分析系统： /span 多光谱病理切片成像系统、数字切片扫描分析系统 /p p 　　 span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 活体成像系统： /span 2D/3D小动物活体成像系统 /p p 　 span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 　电子显微成像系统： /span 300KV冷冻透射电子显微镜、200KV透射电子显微镜、100KV透射电子显微镜、场发射扫描电镜 /p p 　　 span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 流式细胞分析系统： /span 分选流式细胞仪、分析流式细胞仪、质谱流式细胞仪 /p p 　　武汉病毒所的分子影像平台是其特色的技术平台。“我们这一套东西已经发展了几十年，在技术积累和传承方面都很成熟和完善，比较有优势。” /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 从高分辨率显微成像到动物活体影像，横跨微观到宏观的多尺度研究手段 /strong /span /p p 　　近几年来，武汉病毒所仪器平台建设在最早的以电子显微镜技术为特色的科研服务基础上，扩展了荧光显微镜方向和一些生物大分子分析仪器，先后引进了珀金埃尔默(PerkinElmer)公司的Operetta高内涵筛选系统、UltraVIEW VoX双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜、IVIS Spectrum小动物活体三维成像系统、Vectra多光谱组织成像系统等仪器，涵盖从细胞到活体到组织的各研究对象，完成了从微观到宏观各尺度科研手段的覆盖。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/391966ef-787a-4ac0-a6d6-1878340029a2.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong Operetta 高内涵筛选系统 /strong /p p 　　引进这些仪器是出于何种考虑呢?高丁解释说：“我们在做平台建设时，主要是考虑到从生物学的尺度上来完善仪器的使用链，包括从分子成像一直到活体动物成像，中间跨度从分子、病毒、细菌、细胞器、细胞、组织、器官到小动物这样横跨纳米到厘米级尺度的成像。所以我们一直在补充完善整个平台，就是为了实现整个跨尺度的研究。研究病毒是从它的生物大分子开始，一直研究到它对活体的影响，所以这个仪器链也是必须的。” /p p 　　从尺度上来讲，双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜可以用来研究病毒侵染、细胞内病毒与细胞器之间相互作用关系的实验，观察病毒的动态。高内涵筛选系统可以在稍微宏观一点的基础上看药物对病毒侵染的影响，并且可以在细胞学水平对药物的抗病毒效果进行评价。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/014d9be3-3b5b-43e6-8a21-3b788f1a6031.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong Vectra多光谱组织成像系统 /strong /span /p p 　　从前做药物筛选就是做一些生化试验，比如在96孔板上加各种药物、病毒蛋白和宿主蛋白，来分析它们之间的相互作用，是用化学手段或者是分子生物学手段间接测得一些数据，并不能完全反应真实的相互作用关系。这时就需要双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜、高内涵筛选系统在活细胞内或者组织细胞内对几万甚至几十万个细胞做进一步可视化分析，用可视化的数据来进一步验证实验结果。“借助双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜，我们实现了在活细胞水平对病毒侵染细胞过程的实时观测 借助Opereta高内涵筛选系统，我们建立基于细胞表型的抗病毒药物筛选平台，并基于我们完善的抗病毒药物评价体系，我们跟很多药企建立了横向合作关系，产生了良好的社会效益，同时也发挥了我们所的病毒库资源优势。” /p p 　　做完细胞水平的研究后，就可以进入到活体小动物水平的研究了。用小动物活体成像系统观察病毒在小动物体内的繁殖、侵染过程，以及药物与病毒之间的相互作用。 /p p 　　“我们做实验就是要从体外做到细胞级，再做到动物级。这三个层级是完全不同的情况，不能互相替代，所以整个仪器链条一定要补充完整才行。”高丁博士如是说。 /p p 　　仪器用在工业领域往往是在做重复的工作，而科学研究则有很大差别。生物学研究涉及各种各样的实验，科研院所内不同课题组、不同研究人员的研究方向都不一样，因此要求共享的大型仪器性能要尽可能高，功能要尽可能丰富。 /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 病毒研究要求更高灵敏度、成像速度及安全性 /strong /span /p p 　　那么现有技术是否能完全满足病毒研究的要求呢?高丁博士表示，还需进一步提升荧光显微镜的灵敏度和成像速度。“对于病毒学来说，要做一些病毒侵染、示踪实验，观察病毒在细胞内的一些些动态行为，以及病毒与细胞内细胞器或蛋白的相互作用。因为病毒在细胞内运动速度非常快，这就需要荧光显微镜在很短的曝光时间内捕捉到细小的相互作用关系。病毒非常小，能染上的荧光也比较弱，现有技术的成像速度和灵敏度还是不够，这样就会丢失很多信息。所以需要提升荧光显微镜的灵敏度和成像速度来捕捉病毒的行为。” /p p 　　高丁博士介绍说，中心现在用的UltraVIEW VoX双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜，可以在保持高分辨率的同时实现快速成像。“UltraVIEW VoX的成像速度大概是30帧/秒，分辨率大概是250纳米左右。这个速度比以前已经提高很多了，灵敏度也得到了保证，已经初步能实现我们想拍的一些画面和视频。但是对于病毒学研究来说，对于成像的速度和灵敏度以及分辨率还有更高的要求，对仪器供应商来说还有更大的提升空间。” /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/16a8c880-2f1b-4514-81c7-df7eb6bdffdf.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong UltraVIEW VoX双碟片活细胞荧光共聚焦显微镜 /strong /p p 　　高丁博士承担了中科院仪器研制项目。“我们这个所比较特殊，有高等级生物安全实验室，里面摆放不了高精密的大型仪器。所以我们根据这个需求，想设计一套方案来实现P3以下的实验可以在生物安全实验室外面做。因为生物安全实验室对场地和仪器有要求，日常消毒会破坏摆放在里面的高精密仪器。但是实验室进出非常麻烦，而且需要频繁进行过氧化氢腐蚀性消毒，价值几百万的仪器遇到腐蚀的东西很快就坏掉了。所以我们就希望能研究出满足生物安全等级的仪器，把实验带到常规实验室去做。” /p p 　　 span style=" font-family: 宋体, SimSun " strong span style=" color: rgb(0, 0, 0) " 高丁简历 /span /strong /span /p p span style=" font-family: 宋体, SimSun " 　　高丁，男，博士，高级工程师，2012年毕业于中科院武汉病毒研究所。现为中国科学院武汉病毒研究所分析测试中心负责人。负责研究所大型仪器平台的管理、维护、开发工作。长期从事病毒蛋白纳米自组装及其应用研究，包括SV40病毒衣壳蛋白包装纳米颗粒机制 多层级复杂杂合病毒纳米结构的构建 基于病毒衣壳蛋白的多尺度微纳米包装颗粒细胞递送系统 包装颗粒的病毒抗体检测应用等。 /span /p p span style=" font-family: 宋体, SimSun " 　　 strong 关于中科院武汉病毒所所级公共技术服务中心 /strong /span /p p span style=" font-family: 宋体, SimSun " 　　武汉病毒所公共技术服务中心由50年代电镜室发展而来，经历电镜室、分析测试中心、所级中心三个阶段，是研究所下属独立建制的技术支撑平台。中心实行“科学管理、开放共享、服务科研”的运行机制，由分管所领导担任中心主任，实行主任负责制。中心下设平台管理委员会、公共技术平台管理办公室，以及五个专业技术实验室(中心)，包括分析测试中心、实验动物中心、BSL-3实验室、放射性同位素实验室。 /span /p p span style=" font-family: 宋体, SimSun " 　　中心作为研究所公共技术服务平台，负责统一管理研究所公用科研设施和仪器设备，确保这些设施设备在高度共享公用的机制下运行，同时参与制定研究所公用科研设施和仪器设备的发展规划、购置方案，面向所内外开展各类实验技术培训。 /span /p p span style=" font-family: 宋体, SimSun " 　　中心共有工作人员25人，其中正高2人，副高4人 拥有博士学位3人，硕士学位9人。中心现有共享仪器设备228台套，设备总价值达12941万元，共享设备年有效总机时数117244小时，其中由中心集中管理的仪器设备共36台/套(5254万元)，年有效机时数达53290小时 委托学科组管理的仪器设备共192台/套(7687万元)，年有效总机时：63954小时，总平均共享率79%。 /span /p p span style=" font-family: 宋体, SimSun " 　　其中分析测试中心包含电子显微平台、荧光显微平台和生物大分子分析平台等。主要仪器有：300KV冷冻透射电子显微镜、200KV透射电子显微镜、100KV透射电子显微镜、场发射扫描电镜、超高分辨率荧光显微镜、双碟片共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜、病理切片全景扫描系统、光谱型病理切片成像仪、小动物活体成像仪、质谱流式细胞仪、分选流式细胞仪、分析流式细胞仪、生物大分子相互作用分析仪，分析型超速离心机、冷冻超速离心机等。 /span /p

研究背景Nature：清北团队合作发现CRISPR免疫增效子，建立Cas9核酸酶生长进化模型CRISPR-Cas系统是一种强大的基因编辑工具，但Cas9核酸酶活性仍需提高。现有的方法存在着种种局限性，例如优化序列可能破坏结构、改变表达方式可能导致副作用、使用辅助蛋白会增加复杂性等。因此，开发新的方法来增强Cas9核酸酶的活性仍是CRISPR-Cas系统研究中的一个重要课题。2024年5月29日，来自清华大学和北京大学的研究团队在Nature上合作发表了题为：Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity的研究论文研究团队通过生物信息学分析、结构生长轨迹分析、生化实验、冷冻电镜解析和大肠杆菌抗噬菌体实验等手段，发现了一类新型CRISPR免疫增效子PcrIIC1，可以显著增强Cas9核酸酶的活性。研究团队还建立了Cas9核酸酶生长进化模型，揭示了Cas9蛋白结构和功能的演变规律，并阐明了PcrIIC1增强Cas9活性的分子机制。这项研究为我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，以及开发基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具奠定了基础。研究思路通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程。图1. 结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。图2. 冷冻电镜分析CbCas9和PcrIIC1结合的三个阶段蛋白质与核酸的分子互作实验表明，与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。研究利用溶液中标记的分子互作方式获得亲和力，得出与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合（图3a）进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。图3. PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和错配容忍 (e) 能力最后，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。图4. PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性FIDA如何更好复现Nature蛋白与核酸互作发文思路流体动力分散技术（FIDA）通过第一性物理原理直接获取分子的绝对流体动力学半径（Rh），通过追踪分子微妙的变化来表征生物分子的行为、特征以及功能。Fida Neo分子互作仪涵盖亲和力表征、亲和动力学表征、分子质量表征三大功能，一次实验即可获得互作与分子质控的数据，让互作的数据有“法”可依。FIDA技术无需固定、无需加热，甚至无需标记，可兼容所有缓冲液，是对现有分子互作技术是一次不一样的升级。FIDA技术可用于CbCas9-PcrIIC1复合物冷冻电镜前样品质控，CbCas9-PcrIC1复合物与DNA的亲和力实验以及动力学实验，以及CRISPR- cas以及核酸复合物的大小和定量表征等方面，具体如下:FIDA多维蛋白复合体表征，快速无稀释优化冷冻电镜样品，丰富您的蛋白质表征数据。FIDA所获得的Rh为绝对的粒径大小，可以直接与后期的电镜数据做比较。此外FIDA内置的 PDB 关联程序，可以将实际获得的 Rh 与数据库中的结构信息进行比较，有助于结构的精细解析。FIDA技术单次运行只需要40 nL 蛋白质在 4 分钟内获得的完整蛋白质 QC 图，包括冷冻电镜样品QC的关键参数表征，例如多分散性指数（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（Rh）等指标，FIDA是一种非常有效的支持所有生物物理学和结构生物学的基本工具。图5. FIDA单次测试的得到8个蛋白表征数据冷冻电镜应用：FIDA：4分钟给您无稀释的冷冻电镜样品优化解决方案FIDA和本篇研究中应用的分子互作技术都是一种在溶液状态下通过荧光分子标记表征分子互作的技术。对于蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现蛋白与蛋白或蛋白与核酸互作的真实情况。FIDA 可以使用含盐和洗涤剂的缓冲液条件，具有不同环境中（类体内环境）进行测试的灵活性。这使得研究者能够分析不受缓冲液成分限制的核苷酸，以确保其数据的准确性和可靠性。FIDA 这种在溶液内检测分子互作技术，是理想的结合能力检测，因为它不依赖于潜在的阻碍性表面固定，不受结合域空间方向影响的表征。图6. FIDA实验原理示意图FIDA不仅可以表征互作亲和力，也同时无标记检测CRISPR核酸酶与gDNA相互作用的热力学、亲和力、和结合动力学，全面表征蛋白与核酸互作。FIDA不仅可以完成本研究中得到的CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合亲和力，还可在无标记下表征蛋白与核酸的热力学参数与结合动力学，甚至表征结合时蛋白构象变化与获得有关基因编辑过程的分子细节的定量表征。FIDA技术可以处理带负电荷分析物和带正电荷配体，使利用FIDA能够深入了解CRISPR- cas组分之间的结合相互作用，并以更高的准确性和效率表征和优化CRISPR系统。FIDA是一种序列无关的技术-不需要事先了解序列。FIDA的序列独立性质可对未知或未表征的基因组区域进行研究，同时简化工作流程。图7.(A) FIDA实验示意图。ReporterRNA用于识别RNP的大小和饱和点(上)，用其报告RNP结构作为竞争分析的起点(下) (B)正向结合(上)和反向滴定(下)期间获得的原始FIDA数据 本研究在分子层面直观的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。首次发现了一类新型的CRISPR免疫增效子可以通过二聚化Cas9效应器提升Cas9活性，这些结果不仅有助于我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，还为未来基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具的开发奠定了基础。FIDA对于蛋白质复合体的多维表征和对蛋白与核酸互作亲和力与动力学的的检测，不依赖于分子量变化，样本用量少（仅需40nL），是一种在溶液状态下且不受缓冲液成分影响的多维表征技术。对于在本研究中相似的蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现互作的真实情况。