细胞治疗

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

2021年11月4日，加州大学尔湾分校的Leigh Turner在Cell Stem Cell上发表了文章The American stem cell sell in 2021: U.S. businesses selling unlicensed and unproven stem cell interventions，描述了2021年美国商业化的干细胞市场现状。文中提到2021年3月，美国有1480家企业运营2754家诊所在出售所谓的针对各种疾病的干细胞治疗产品，这一数据是5年前的4倍多。这些干细胞治疗产品并未经过FDA批准，同时缺乏支持安全性和有效性的相关证据。值得多说一句的是，近些年，Leigh Turner在包括Nature等杂志上发表过多篇对于干细胞临床化的评论性文章。引言目前，近1500家美国企业有做广告表示他们可以进行针对各种疾病乃至受伤的干细胞治疗，尽管这些产品没有经过FDA授权，以及没有令人信服的临床证据。在20年前，就已经有企业在出售未授权或未批准的干细胞治疗产品。之后，这一市场急剧扩大，美国政府也出台了与干细胞治疗相关的详细法规以规范这一市场，包括FDA如何解释和应用这些法规的指导性文件，和企业进入这一市场的监管机制文件。通过对干细胞治疗网上广告的调查，发现美国公司销售此类产品比世界其他任何国家都要多，甚至一度成为“干细胞旅游”的目的国。为了调查美国干细胞治疗现状，作者应用了Google对2016至2021年之间的数据进行了搜索和分析，这些数据包括企业或者诊所的位置、干细胞产品的类型、产品定位、价格、企业分类等等。企业或诊所的地理分布截至2021年3月31日，美国有1480家企业经营的2754家诊所在出售直接面向消费者的干细胞治疗产品。这些诊所主要分布于3个州，加州（347家）、佛罗里达州（333家）、德克萨斯州（310家），这三家占据了三分之一（990/2754）以上。第4为亚利桑那州，和新泽西州差不多。虽然前3的州人口数量也多，但是似乎并不完全和人口数量挂钩，比如亚利桑那州的人口数量在全美排第十四。图：每个州里出售干细胞治疗产品的诊所数量干细胞产品类型这些企业刊登的广告中，自体干细胞相关产品最多。671家企业（45.33%）销售的是自体骨髓来源的干细胞产品，437家（29.52%）是自体脂肪来源的干细胞产品，42家（2.83%）是自体外周血来源的干细胞产品，7家是自体骨髓和脂肪来源的干细胞产品。异体干细胞产品也有很多。350家（23.64%）销售脐带血或组织来源的干细胞产品，260家（17.56%）销售羊膜干细胞产品，47家（3.17%）销售胎盘干细胞产品。另外还有25家销售没有指定来源的干细胞产品。在1480家企业中，有595家（40.2%）在销售间充质干细胞产品。大多数企业都在推广他们所声称的特定类型的干细胞产品，然而有220家（14.86%）尽管有相关广告，但是并没有明确声明他们的干细胞来源或者类型。在市场中，也有一些“与众不同的”企业，比如有三家公司销售异种干细胞产品，三家公司销售胚胎干细胞产品，一家公司销售“非常小的胚胎样”干细胞产品。与2016年不同的是，2021年没有销售诱导多能干细胞产品（编者注：诱导多能干细胞就这么没有牌面）。另外，还有一种新型的产品受到了人们关注。有99家（6.68%）销售干细胞来源的外泌体产品。这一现象似乎表现出干细胞“周边”也受到了人们的青睐。图：干细胞产品类型可以看到，这些干细胞产品中骨髓或脂肪来源的自体干细胞最多，但也有干细胞“周边”产品。需要说一句的是，这些产品都需要FDA的批准。产品定位这些干细胞产品主要定位于可以缓解疼痛。在1480家企业中，有1262家（85.27%）表示他们的产品可以用来治疗疼痛综合征。第二常见的是应用于骨科疾病和外伤，有689家（46.55%）企业表示他们的产品可以针对此类疾病。有339家（22.90%）表示他们的产品可以针对运动损伤。顺着往下，134家（9.05%）表示可以治疗神经系统疾病，122家（8.24%）可以治疗免疫相关疾病，95家（6.41%）针对肺部和呼吸系统疾病，94家（6.35%）针对勃起障碍和其他性别相关疾病。88家（5.94%）可以治疗皮肤疾病和伤口，86家（5.81%）声称可以与治疗心血管疾病，54家（3.64%）针对糖尿病，39家（2.43%）针对泌尿系统疾病，36家（2.43%）针对脊髓损伤或瘫痪，29家（1.95%）针对视力损伤，23家（1.55%）针对自闭症和脑瘫，还有37家（2.5%）声称可以治疗成人阿尔茨海默症。除了疾病，有123家（8.31%）针对美容，109家（7.36%）针对脱发，89家（6.01%）针对衰老。图：干细胞产品的定位费用大多数公司没有在其网站上公布其干细胞产品的费用。在1480家企业中，只有56家（3.78%）列出了其产品价格。最低的是1200美元，最高的是28,000美元，平均为5118美元，价格中值为4000美元。对于大多数患者来说，这些干细胞治疗是自付。企业类型在这些销售干细胞治疗的企业中，有335家（22.63%）以干细胞诊所或者干细胞/再生医学机构的形式存在。大多是企业并没有标榜自己为干细胞诊所或者企业，而是使用了其它一些术语，比如缓解疼痛中心（204家，13.78%）、整形外科护理（181家，12.22%）、整合医学（106家，7.16%）、足部医疗（88家，5.94%）、脊椎治疗中心（77家，5.20%）、骨科或运动医学（67家，4.52%）、脊柱治疗（58家，3.91%）、康复（51家，3.44%）、整容手术（50家，3.37%）。也有一些以水疗中心、抗衰老研究所、自然疗法诊所、针灸诊所、激光诊所或牙科诊所的形式存在，只有极少数的挂靠在科研单位。图：企业类型

近几十年来，医疗技术快速发展，对人们健康做出了巨大贡献，但是越来越多难以治愈的疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病和老年痴呆症等发病率也在不断攀升，而以化学药物和手术治疗为支柱的传统西医学发展逐渐遭遇瓶颈。 20世纪末以来，以干细胞技术为核心、被科学界誉为第三次医学革命的再生医学成为了人们治愈此类疾病的新希望。全球干细胞领域领军人物哈佛大学资深医学专家威廉.雷德博士说：“再生医学是继药物、手术治疗后的又一场医学革命，他拥有治愈疾病、器官再生、延长生命的潜能。并且可以完全颠覆我们的行医方法”。 一、间充质干细胞间充质干细胞(MSC)是一类早期未分化细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化潜能等特点，可通过分泌细胞因子，减少炎症、减少组织细胞凋亡、促进内源性组织器官的干祖细胞增殖及进行免疫调节，从而作为种子细胞达到修复组织器官的效果。 目前间充质干细胞治疗各种疾病的临床试验在世界范围内都在如火如荼的进行中，截止目前，clinicaltrial.gov网站注册应用的间充质干细胞相关的临床试验超过950项，中国临床试验注册中心注册的间充质干细胞临床试验超过150项。 二、间充质干细胞治疗优势多向分化：具有强大的增殖能力和多向分化潜能；免疫调节：免疫原性低，有免疫调节功能，使用不引起免疫排斥反应，且可抑制排斥反应；数量丰富：各组织中含量丰富，易于采集。繁殖力强：经体外培养可达10亿个，供多次使用。安全可靠：基因稳定，不易突变，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。适用面广：适用范围广泛，几乎可用于治疗所有的组织损伤、衰老及退行性病变。三、临床产品示例1.移植物抗宿主病：TEMCELL2016年2月，Mesoblast公司的药物在日本获批上市，商品名称TEMCELL。TEMCELL是一款骨髓来源的间充质干细胞产品，主要批准用于儿童和成人的移植物抗宿主病。这是日本国内首个获批的异体细胞治疗药物。2.骨关节炎治疗药物：CartistemMedi-post公司的Cartistem是通过分离间充质干细胞，培养并制成商品化的药物。主要用于治疗由于年龄、创伤、退行性及疾病引起的骨关节炎。爱必信为您提供优质的无血清培养基，助力细胞治疗！爱必信无血清培养基优点：1.无外源动物蛋白成分，大大降低各类病毒、霉菌和支原体等的污染风险。2.全程无血清生产，极大降低批次间差异。3.可用于原代分离，且培养过程无需包被培养板。4.扩增效率高，24h左右增殖翻倍，节省培养时间。5.内毒素 abs9416 成软骨检测染液 100ml 462 abs9415 成骨检测染液 100ml 462 abs9413 无血清细胞冻存液（治疗级） 100ml 1712 abs9417 无血清细胞冻存液（科研级） 100ml 662 abs9402 Xeno-Free人间充质干细胞培养基 100ml/500ml 998/3108 abs9401 Xeno-Free人间充质干细胞培养基（无酚红） 100ml/500ml 998/3108 abs9405 人多能干细胞分化培养基 500ml 2289 abs9404 人多能干细胞完全培养基 500ml 3444 abs9403 人多能干细胞条件培养基 500ml 2772 abs9409 人多能干细胞消化液 100ml 305 abs9420 人脂肪干细胞无血清培养基(无酚红） 500ml 2548 abs9419 人脐带间充质干细胞无血清培养基(无酚红） 500ml 2548 abs9407 人间充质干细胞成脂分化试剂盒 100ml 1953 abs9418 人间充质干细胞成软骨分化试剂盒 100ml 2069 abs9406 人间充质干细胞成软骨分化试剂盒 100ml 2069 abs9408 人间充质干细胞成骨分化试剂盒 100ml 2541 abs9412 ES/iPS细胞冻存液 100ml 1943Absin特色产品线（全部现货）：WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)... 爱必信(上海)生物科技有限公司联系邮箱：info@absin.cn公众平台：爱必信生物