三代测序

在“二代测序”(NGS)尚未迎来投资热潮的情况下，技术突破捷报连连的“三代测序”(3GS)又进入到了投资人的视野中。1986年，第一台商用基因测序设备正式出现，到第二代测序设备出现，期间间隔了19年时间。而第二代设备问世，到第三代设备的诞生，仅仅用了5年，基因测序设备的更新换代速度正在不断加快。这就好比“2G”手机跳过“3G”，直接跨越到了“4G”时代。　　报告通过四个方面对第三代基因测试技术进行分析：　　1、第三代基因测试技术的发展现状 　　2、第三代基因测试方法原理 　　3、第三代极影测试技术优势和劣势 　　4、国内外布局第三代基因测试技术的公司情况。　　1、第三代基因测试技术的发展现状　　以Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为代表的三代测序技术在经过了多年发展后，已经逐步趋于成熟。　　尽管当下该技术还有成本偏高、错误率较高、生物信息学分析软件不够丰富的问题，但其在读长、测序速度等方面都具有明显优势。　　三代测序设备已实现稳定性、小型化，未来随着准确度提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术将成为未来发展的重要技术趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。　　2、第三代基因测序方法原理　　Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。　　与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。　　PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体，芯片上有很多小孔，每个孔中均有DNA聚合酶。　　测序基本原理是：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。　　另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约数个dNTP。　　但是，同时其测序错误率比较高(这几乎是目前单分子测序技术的通病)，达到15%。但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错(代价是重复测序，也就是成本会增加)。SMRT技术原理图　　Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。　　该技术的关键之一是，设计了一种特殊的纳米孔(只能容纳单分子通过)，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的)，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。Nanopore技术原理图　　3、第三代基因测序技术的优势和劣势　　相比于二代测序，三代测序具有如下优势：　　1、第三代基因测序读长较长。如Pacific Biosciences公司的PACBIO RS II 的平均读长达到10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。　　2、直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了PCR扩增带来的出错。　　3、拓展了测序技术的应用领域。二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。　　4、三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测 在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。　　同时，第三代基因测序也存在一定的缺陷：　　1、总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因 第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率(低于1%)。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错(但这要增加测序成本)。　　2、三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。　　3、成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。　　4、生信分析软件也不够丰富(如图所示)：一、二、三代基因测序技术对比图　　4、国内外布局三代测序的公司情况　　国外布局三代测序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015年10月27日，国内公司瀚海基因(Direct Genomics)公布了基于Helicos技术研发的专门用于临床的第三代单分子测序仪GenoCare 原理样机。　　中科院北京基因组研究所与浪潮基因组科学也在共同研制国产第三代基因测序仪。在测序仪价格方面，PACBIO 2011年的第一台三代测序仪PacBioRS在美国价格80万美金，2015年生产的sequel测序仪价格35万美金，大幅下降。在测序成本方面，预计未来5年内三代测序能达到100美元全基因组测序的价格。国内外布局三代测序的公司　　第三代测序技术是大势所趋　　从兴证医药健康这份报告中可以看到：目前，第三代测序在技术上相对于二代在读长和测序速度等方面有明显优势，但在成本和准确率等方面还有待提升。目前国内只有瀚海基因在三代测序上有临床成果，而国外已经初步实现技术商业化。总体而言，第三代测序技术是未来发展趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。　　本篇报告内容由动脉网整理自兴证医药健康投资报告

p style=" text-align: center " 　　近日，中国科学院昆明动物研究所研究员张亚平和马占山领导的团队发布了以“10x Genomics测序”辅助“三代测序”的混合组装策略和软件技术。研究人员采用美国加州大学Jain等人2018年发表在Nature Biotechnology上（doi: 10.1038/nbt.4060.）的人类基因组三代测序数据进行了示范测试，结果表明，新方法能够将测序深度从Jain等所用的35倍降低至7倍，降低幅度达80%；转换成测序成本，新技术成本大约是纯三代测序的1/4。该技术发明专利已正式受理，该研究成果在线发表在Genomics上。新技术由于能够大幅度降低三代测序所需成本，从而为进一步推进测序技术从目前主流的二代技术向三代技术的产业升级再次提供了良好契机。 /p p 　　基因测序技术系生命科学和生物科技的核心技术之一，目前正处在从主流的二代测序技术向三代技术进行产业升级的过渡阶段。三代技术以其超长读段（最新技术可达1兆），较之以短读段取胜的二代技术具备诸多技术优势，无疑是测序技术的未来。但三代技术在与二代技术竞争中，也存在两大劣势，其一是三代测序硬件（测序仪）的碱基水平（base-pair）错误率至今仍然高达15%（二代测序错误率不到1%），其二是目前测序成本仍然居高不下。 /p p 　　事实上，三代测序超高错误率也使得三代测序数据的组装分析遇到了极大挑战。例如，2014年，主流的三代基因测序软件在组装人类基因组时，仅“多重比对”一步就耗时400,000个CPU小时，而且是借助了谷歌公司超级计算机集群。2014年，马占山与美国马里兰大学博士叶承羲合作发布的三代测序组装软件（DBG2OLC）将这一计算步骤减少到了大约6小时，而且是在一台普通工作站完成的。DBG2OLC使得原本需要超级计算机集群才能完成的计算可以在普通工作站上完成，目前DBG2OLC仍然是三代测序软件中运行速度最快、内存需求最少的软件和算法。2016年他们合作发布了另一款用于三代测序纠错的软件SPARC，该软件将三代测序软件技术的组装错误率降低到0.5%以下；与当时最优秀的同类软件相比，可节省计算时间和内存达80%。DBG2OLC和SPARC软件不仅有效弥补了三代测序硬件技术超高错误率的缺陷，而且也为最新的“10x技术辅助的混合三代测序”奠定了高效、可靠的算法和软件基础。此次发布的技术仍然得到了叶承羲的支持和帮助。 /p p 　　马占山为文章的第一作者，马占山和张亚平为文章的共同通讯作者。相关工作得到国家自然科学基金、云岭产业技术领军人才、云南省国际合作基金等的资助。 /p p 　　 a href=" https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0888754318305603?via%3Dihub" target=" _blank" 文章链接 /a /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/3fa6a6e3-3d86-46e1-ba9a-08f4932a08c0.jpg" title=" W020190111417379530832.jpg" alt=" W020190111417379530832.jpg" / /p p style=" text-align: center " 昆明动物所在三代基因测序领域取得进展 /p p br/ /p

DNA基因测序技术从上世纪70年代起，历经三代技术后，目前已发展成为一项相对成熟的生物产业。测序技术的应用也扩展到了生物、医学、制药、健康、农林、园艺、花卉、环保、法医等许多领域，并成为一项与我们衣食住行密切相关的高技术产业。据最新统计，2012年全球基因测序市场的产值已超过百亿，按最近几年增长速度，预计2017年市场产值将加倍。在测序产业占世界市场份额第一的正是总部设在深圳的我国华大基因研究院。因此可以说，基因测序在我国生物科技领域具有非常重要的战略意义。 　　&ldquo 第三代测序技术&rdquo 的研发已有近十年时间，商业化的第三代测序仪上市也有三年。但目前测序市场仍为二代测序技术所垄断(我国顶级科研机构和商业公司所拥有的三代测序仪可能仅有数十台)。三代测序技术产生的读段更长，测序成本更低，其取代二代技术是测序技术发展的必然趋势。然而由于三代测序技术错误率高，现有的组装软件多是对第二代测序数据组装软件的&ldquo 修补&rdquo 而并没有充分考虑到三代测序技术的数据特征。事实上，基因组装算法问题被广泛认为是计算生物学和生物信息学领域最复杂的计算难题之一，也是目前阻碍基因测序产业从二代技术升级到三代技术最大的技术障碍。 　　最近，美国马里兰大学 Chengxi Ye, James A. Yorke, Aleksey Zimin 等与中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室马占山研究员在这一领域的合作研发取得新突破。该研究团队在一篇题为DBG2OLC: Efficient Assembly of Large Genomes Using the Compressed Overlap Graph 的文章中引入了一种新的针对三代测序技术的基因组装算法，并开发出一款软件(DBG2OLC)。另外作者(Ye et al. 2011, 2012)于2011年发布的SparseAssembler曾经比当时主流的基因组装软件节省90%的内存空间，而其计算时间和组装质量却毫不逊色。著名的SOAPdenovo的升级版，也是目前最广泛应用的基因组装软件SOAPdenovo2即采用了SparseAssembler算法。 　　多组测序数据的测试表明：与目前用于三代测序最优秀的一些基因组装软件(例如PacBio2CA, HGAP, ECTools)相比，DBG2OLC在计算时间和内存空间的消耗通常仅为其它算法的1/10。理论上，DBG2OLC在时间和空间的使用上相对其它同类软件可减少达1000倍。例如组装关键步骤之一的&ldquo 两两比对&rdquo 计算，采用一组由 PacBio提供的人类基因组数据，DBG2OLC 使用一台普通PC仅用了6小时完成。而同样计算，Pacific Biosciences所报道的时间为 405000 CPU小时，而且是在Google的计算集群上完成。因此，DBG2OLC 算法基本解决了目前三代测序技术所面临的计算技术挑战，从而为推进基因测序技术的产业升级奠定了良好的技术基础。