霉变大米

12月8日早间，“女子接触霉变玉米后肺部长满真菌”冲上热搜第一。据人民网，一23岁女子前段时间回老家帮忙收玉米，事后连续1个多月咳喘不止。经医生检查，她的肺部长满了黄曲霉菌，引发了真菌感染。该女子回忆，当时她在无防护措施情况下收玉米，有些玉米可能淋雨霉坏。[1]什么是黄曲霉毒素？黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。当粮食未能及时晒干及储藏不当时，往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素。在各类食品中，花生、花生油、玉米污染最严重。黄曲霉毒素是一种剧毒的致肝癌物质，人摄入大剂量的黄曲霉毒素后可出现肝实质细胞坏死、胆管上皮细胞增生、肝脂肪浸润及肝出血等急性病变。事实上，世界范围内有多次黄曲霉毒素急性中毒事件，非洲的霉木薯饼中毒，印度的霉玉米中毒，肯尼亚黄曲霉玉米污染事件… … 所以把食物中的黄曲霉毒素控制在安全值以内，也是各国都在严格把关不敢松懈的事儿。[2]怎么鉴别食物中是否黄曲霉素超标？首先是快速识别，黄曲霉素是很苦的，食用花生、核桃等食物时如果感觉很苦，马上吐出来，并漱口。此外，睿科集团建立了Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪测定玉米、大米和花生油中黄曲霉毒素B族和G族的分析方法，供广大食品检测客户参考。试样经过70%甲醇水溶液提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉素特异抗体的免疫亲和柱自动净化。用20mL水淋洗柱子将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱。将洗脱液在50℃条件下氮吹干，用1mL初始流动相定容，经高效液相色谱仪上机分析。图-1.4种黄曲霉毒素的结构式下文参考GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中第三法，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测，建立了复杂粮油样品基质中黄曲霉毒素高灵敏度的前处理和分析方法，得到四种常见粮油样品中黄曲霉毒素的加标回收率在83-100%之间，RSD值小于5%。1.标准曲线配置使用睿科Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站可实现标准品的全自动化配置，可将购买的混合标液（1000ug/L）通过工作站的直接稀释模式，配置成浓度为10ug/L的工作中间液，紧接着可通过程序设置，吸取该工作液，配置一条浓度分别为0.5ug/L，2.0ug/L，5.0ug/L，25ug/L和100ug/L的标准工作曲线。图-2. Auto Prep 200 液体工作站配标程序2.样品提取与前处理花生油样品前处理准确称取5g花生油样品于50mL离心管中，加入20mL甲醇-水溶液（7:3）（v/v），涡旋震荡提取20min，以7000r/min的转速离心5min，取4mL上清液于80mL玻璃上样管中，加入23mL 0.1%吐温-20的PBS缓冲液混匀，待用。（此处以花生油样品前处理为例，玉米粉、大米样品操作步骤同上）固相萃取净化条件全自动固相萃取仪Fotector Plus固相萃取柱黄曲霉毒素免疫亲和柱（Romer，60 mg/3 mL）淋洗超纯水洗脱甲醇表-1 固相萃取净化条件以2mL/min的速度精确上样27 mL待测液，10mL水润洗样品瓶，10mL水淋洗免疫亲和柱，气推30mL吹干免疫亲和柱，推速为80mL/min。最后用2mL甲醇以0.5mL/min的速度洗脱样品，收集洗脱液用睿科Auto EVA-60全自动平行浓缩仪于50°C、2psi条件下氮吹干，用初始流动相定容至1mL，过滤膜上机分析。详细步骤见图-3。图-3. Fotector Plus 黄曲霉毒素免疫亲和净化方法3.样品测试油样加标测试取空白花生油样5g，添加2ug/kg的黄曲霉毒素G2、B2、G1和B1的标准品，进行上述步骤的前处理净化，样品回收率如下表-2所示：表-2添加水平为2ug/kg花生油样的回收率大米样品加标测试大米中添加水平为2ug/kg的黄曲霉毒素G2、B2、G1和B1的回收率结果：表-3添加水平为2ug/kg大米的回收率结果玉米样品加标测试玉米中添加水平为2ug/kg的黄曲霉毒素G2、B2、G1和B1的回收率结果：4.注意事项由于黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定，因此在实验过程中应该避免紫外光和太阳光的照射。谷物中离心完成后，不可放置过长时间，否则谷物容易重新吸水，可能导致提取液的浓度过高，使样品的回收率偏高，影响测试结果。固相萃取进行提取液净化前，特别对于偏酸或偏碱性样品，应用PBS缓冲溶液（pH=7.4）进行稀释后上机，否则可能会导致回收率偏低。5.总结净化

霉菌是真菌的一种，有的能使食品转变为有毒物质，有的可能在食品中产生毒素，即霉菌毒素 。自从发现黄曲霉毒素 以来，霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。主要表现为慢性中毒、致癌、致畸、致突变作用 。比如，在1993年被世界卫生组织（WHO）癌症研究机构划定为一类天然存在的致癌物的黄曲霉毒素，是毒性极强的剧毒物质，对人体健康造成的危害极大。霉菌毒素对粮油及其制品、各种植物性与动物性食品、水分含量较高的禾谷类作物都能造成污染。人或动物特别容易通过误食这些食品或其加工副产品，又经消化道吸收毒素进去人体。进而在肝、肾、肌肉、血、奶及蛋中可测出毒素，所以霉菌毒素的检测工作尤为很重要。霉菌及其毒素的产生也是渐变的，从无到有，从少到多。我们常说，抛开剂量谈毒性是耍流氓。霉菌毒素亦是如此，所以在关于食品霉菌毒素的检测工作中，霉菌毒素的检测限越低，霉菌毒素发现的越早，对我们的食品安全检测工作就越有利。比如，花生作为我国主要的油料经济作物之一，在加工贮藏等环节极易受到黄曲霉菌的侵染而失去使用价值。挖掘黄曲霉菌污染发生早期预警标识分子对于花生霉变的早期监测预警具有重要意义。在近期的研究中，科研人员将气相离子迁移谱(GC-IMS)技术用于食品相关样品的霉菌检测研究，相对于传统的液相色谱法、荧光光度法具有检测限更低、速度更快的特点。气相离子迁移谱（GC-IMS）技术结合了气相色谱的高分离度与离子迁移谱的高灵敏度，固体/液体样品无需固相微萃取，直接顶空进样分析，检出限可达到ppbv级别，典型分析时间5-15min,结果以直观可视的指纹图谱形式将样品中风味物质的差异呈现出来，可对单一/标记物进行定性、定量分析，也可对样品中所有挥发性有机物进行非靶向分析。气相离子迁移谱采用气相离子迁移谱（GC-IMS）技术对花生中黄曲霉侵染过程中挥发性有机化合物进行分析，通过挥发性物质的指纹谱图观察侵染过程中各阶段挥发性物质的变化规律和相对含量的变化，根据特征峰图片库结果结合化学计量学方法可以对花生的早期霉变程度进行有效的区分。热图聚类分析和主成分分析比较不同化合物之间的差异性和相似性，结果表明不同侵染阶段挥发性有机化合物差异明显，具有明显区分度，如己酸、2，3-丁二酮、2-己烯-1-醇-M、 戊-1-醇-M 和己醛可作为花生早期霉变的潜在生物标志物。该结果为仓储条件下花生霉变程度的早期预警监测体系开发提供了有效的标识分子。江苏大学食品与生物工程学院陈斌教授课题组基于GC-IMS联用技术在大米霉变早期监测做了相关研究，使用GC-IMS对分离的单一霉菌的mVOCs进行分析，发现菌种不同代谢产生的挥发性有机物不同，借助指纹图谱找到6种霉菌共性的挥发性有机物，根据挥发性有机物含量的变化用于大米霉变的早期筛查研究。以下为GC-IMS技术在粮食霉变早期筛查中的应用，欢迎查阅：1. Targeted versus Nontargeted Green Strategies Based on Headspace-Gas Chromatography−Ion Mobility Spectrometry Combined with Chemometrics for Rapid Detection of Fungal Contamination on Wheat Kernels. J. Agric. Food Chem 2020, 68, 12719−12728. 2. Rapid determination of potential aflatoxigenic fungi contamination on peanut kernels during storage by data fusion of HS-GC-IMS and fluorescence spectroscopy. Postharvest Biology and Technology 171 (2021) 111361.3. Rapid detection of Aspergillus spp. infection levels on milled rice by headspace-gas chromatography ion-mobility spectrometry (HS-GC-IMS) and E-nose. LWT - Food Science and Technology 132 (2020) 109758.4. Early detection and monitoring for Aspergillus flavus contamination in maize kernels. Food Control 121(2021)107636.5. A study on volatile metabolites screening by HS-SPME-GC-MS and HS-GC-IMS for discrimination and characterization of white and yellowed rice. Cereal Chemistry 2020 00:1–9.6. Determination of volatile organic compounds by HS-GC-IMS to detect different stages of Aspergillus flavus infection in Xiang Ling walnut. Food Sci Nutr DOI: 10.1002/fsn3.2229.7. GC-IMS联用技术在大米霉变早期监测中的研究应用.江苏大学. 2019.8. 气相离子迁移谱联用技术评定大米霉变程度的研究应用. 中国粮油学报. 2019.9.高效识别黄变与正常稻谷中差异小分子物质的检测方法.申请公布号：CN109324124 A.天津科技大学. 2019.10.一种玉米花生核桃黄曲霉侵染霉变的特定分子标记物及利用其进行早期霉变检测的方法. 申请公布号： CN 111521708 A. 陕西科技大学. 2020.11.基于离子迁移谱的玉米霉变早期预警标示分子研究.中国食品科学技术学会第十七届年会摘要集.2020.

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