成像方法

p 　　现代生物学研究已经不再停留在仅从组织中识别一种特殊的化学成分，或者蛋白成分上了，我们需要精确的了解这些物质是如何分布，如何构成的，解答这些问题需要更进一步的实验技术，比如免疫组化或免疫荧光检测方法，但是这些技术需要特殊的抗体，而且效率低，偏差大。 /p p 　　因此研究人员将目光转向了质谱技术上，以质谱为基础的成像方法不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，不需要对待测物进行标记，分析物可以其最初的形态被检测，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量，适用于研究生物分子的反应。 /p p 　　质谱成像(Imaging Mass Spectrometry,IMS)这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的 “结构、空间与时间分布”信息。其基本流程(以质谱分析生物组织标记物为例)见下： /p p style=" text-align: center " img title=" 9a504fc2d56285350618456392ef76c6a6ef63fc.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/640b0273-3ad1-4c6a-b6bf-22df33199709.jpg" / /p p 　　简单而言，质谱成像技术就是借助于质谱的方法，再配套上专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。但是随着这项技术的不断发展，也陆续出现了许多针对各种问题的新技术。 /p p 　　最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI，matrix assisted laser desorption ionization)质谱分子成像技术，由范德堡大学(VanderbiltUniversity)的Richard Caprioli等在1997年提出，他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。 /p p 　　正如数字图像包括三个通道：红、绿、蓝一样(单个亮度定义了每个像素的颜色)，质谱成像也包含了数以千计的通道，每一个对应于一个特殊的光谱峰值，“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号，然后调整图像中所需分子像素的相对亮度，最后得到一张分子特异性的成像图。” /p p 　　这种方法可用于小分子代谢物、药物化合物、脂质和蛋白，而且质谱成像能相对快速的利用许多分子通道，完全无需特殊抗体。下面列出五种先进的质谱成像方法。 /p p 　　 strong I. 挑战高分子量蛋白——MALDI质谱分子成像技术 /strong /p p 　　在对组织或生物体进行成像，分析小分子构成的时候，有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程，那就是多肽，这些多肽体积十分大，要想对它们进行分子成像几乎是不可能的，比如想要研究肿瘤边缘的分子微环境，如果直接成像是不可能获得清晰图像的。 /p p 　　来自范德堡大学的质谱方法专家Richard Caprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分子成像技术，这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。 /p p 　　MALDI 质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI 系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比(m/ z)信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/ z 的范围，即可确定该组织区域所含生物分子的种类，并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位，每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。 /p p 　　通过增加单位面积上轰击的激光点数量和像素，研究人员可以获得更多的样品信息，例如采用4000 像素比200 像素能够得到更好的样品图像。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术，图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分。然而，不可能据此确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。选择组织图像上的任意一个斑点，图像都能够给出一个质谱谱图或者离子谱图，代表在组织的该部位存在这种生物分子，然后与做指纹图谱类似，像做指纹图谱那样，将样品的离子谱图与已知标准品进行对照，分析差异，从而进行生物标志物的发现和药物作用的监控。 /p p 　　 strong Ⅱ. 无需样品处理 实时成像——电喷雾电离技术 /strong /p p 　　一般质谱成像方法由于体积庞大，重量重，需要冗长的样品准备阶段，因此并不适用于即时成像(bedside applications)，比如说要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控，那么就要寻找新的方法了。 /p p 　　一种称为电喷雾电离技术(desorption electrospray ionization，DESI)的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出，由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下，从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。 /p p 　　这种方法的原理是带电液滴蒸发，液滴变小，液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源：SIMS(二次离子质谱)有些相似，只是前者能在大气压下游离化，发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法，即利用快速带电可溶微粒(比如水或者乙腈acetonitrile)进行离子化，然后冲击样品，获得分析物的方法。 /p p 　　DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理，一般质谱和高效液相色谱分析，样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测，使得一次样品检测常常需要约一个小时，而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程，只需3分钟左右即可完成。 /p p 　　 strong Ⅲ. 活体成像——APIR MALDI/LAESI技术 /strong /p p 　　了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键。但是直到目前为止，唯一的方法是观察单个细胞的内部，然后将其从动物或植物中移除，或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话，会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别，或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。 /p p 　　来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析，在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中，研究人员发现叶片中积累基质很厚，常导致光谱末端低分子量部分模糊，而且基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱分析需要在真空中进行，但活体样本在真空中无法存活。 /p p 　　实际上，MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。而生物样品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。 /p p 　　因此Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线(an atmospheric pressure infrared，APIR)MALDI激光直接激活组织中的水分，使样品气化，就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸，从而获得了离子化微粒，进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电，大部分其实是不带电的，会被APIR MALDI遗漏。 /p p 　　为了捕捉这些中性粒子，Vertes等人采用了第二种方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，激光烧蚀电喷雾电离)，这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒，然后重新电离化。通过对整个样品进行处理，复合这两种方法，就能覆盖更多的分子，分析质量更高。 /p p 　　与一般质谱成像过程不同，Verte的方法还在成像中增加了高度，从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm，高度30mm，这与生物天然的立体像素相吻合，这样科学家们就可以获得天然构像。 /p p 　　 strong Ⅳ. 3D成像——二次离子质谱技术 /strong /p p 　　质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。 /p p 　　但是一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像，来自宾夕法尼亚州州立大学的Nicholas Winograd教授改进了一种称为二次离子质谱(SIMS，secondary ion mass spectrometry)的方法，可以对样品进行完整扫描，三维成像。 /p p 　　SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了，比如分析集成电路(integrated circuits)中的化学成分，这种质谱技术是表面分析的有利工具，能检测出微小区域内的微量成分，具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。 /p p 　　这种技术具有几个优点：速度快(-10,000 spectra per second)，亚细胞构造分辨率(-100 nm)，以及不需要基质。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。 /p p 　　Winograd教授改进了这一方法，他利用了一种新型SIMS光束(carbon-60 磁性球)，这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”(molecular depth profiling)。 /p p 　　C60的能量与其它的离子束相当，却不到达样品表面以下，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60 ，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此这种方法具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。 /p p 　　这里还要说到一点，SIMS和上一技术(APIR MALDI/LAESI技术)都可以对三维成像，但两者也有差别，SIMS方法中，采用高能离子轰击样品，逐出分析物离子(二级离子)，离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化，另外SIMS探针可以探测到100nm的深度，能提供纳米级的分辨率，而MALDI可以探测更深，但空间分辨率较低。 /p p 　 strong 　Ⅴ. 高灵敏度 高分辨率——纳米结构启动质谱技术 /strong /p p 　　质谱在检测生物分子方面有很大潜力，但现有方法仍存在一些缺陷，灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说，需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物，较易错判，因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。 /p p 　　来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱(nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS)的新技术，这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域，从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析，而且还能用于组织成像。 /p p 　　NIMS利用了一种特制的表面，这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物，这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，这种爆发释放出离子化的分析物分子，它们被吸收到表面上，使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料，从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。 /p p 　　通过这种方法可以分析很多类型的小分子，比如脂质，糖类，以及类固醇，虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别，但是这是一种一步法的方法，比MALDI简单多了——后者需要固定组织，并添加基质。 /p p 　　由于含氟聚合物不能很好的离子化，因此会发生轻微的光谱干扰，而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI，所以NIMS产生的生物分子是整块离子化，而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高。 /p p & nbsp /p p & nbsp /p

近日，由浙江大学承担的“近红外多维多目标成像方法技术研究及应用”项目在北京通过了专家验收。 　　项目组制备了一系列基于量子点—生物分子的发射波长位于近红外“医学光疗窗口”的、可适合于活体多标靶多光谱荧光成像的高性能荧光探针 设计出一种在多维多目标分子成像应用中具有较明显优势的基于软纳米聚合物囊泡的分子荧光探针通用平台 研究出高性能近红外荧光探针试剂盒两套。项目组利用所合成的近红外荧光探针和平台开展了小鼠体内多标靶、多光谱荧光成像研究，并制备了可做小动物多维多目标荧光成像研究的实验装置一套。

近年来，以深度学习为代表的计算超分辨方法可在不损失其他成像性能的前提下，提升显微图像分辨率或信噪比，表现出广阔的应用前景。然而，针对生物医学研究必需高保真度、可定量分析的图像要求，深度学习显微成像方法存在三大共性问题：受限于深度学习内秉的频谱频移(spectral-bias)问题，输出图像分辨率无法达到真值(ground truth)水平；受限于超分辨重建、去噪问题的病态性(ill-posed problem)和神经网络模型的不确定性(model-uncertainty)，重建或预测结果的真实性无法得到保障；深度神经网络的训练需要大量数据，但高质量训练数据的采集在许多应用场景下极其困难、甚至无法实现。当前，深度学习显微成像方法的研究和发展如火如荼，并表现出超越传统成像性能极限的潜力，但上述问题阻碍了现有深度学习超分辨或去噪方法在生物显微成像实验中的使用。 　　10月6日，中国科学院生物物理研究所李栋课题组联合清华大学自动化系、清华大学脑与认知科学研究院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院戴琼海课题组，美国霍华德休斯医学研究所博士Jennifer Lippincott-Schwartz，在Nature Biotechnology上，以长文(Article)的形式，发表了题为Rationalized deep learning super-resolution microscopy for sustained live imaging of rapid subcellular processes的论文。该研究提出了一套合理化深度学习(rationalized deep learning，rDL)显微成像技术框架，将光学成像模型及物理先验与神经网络结构设计相融合，合理化网络训练、预测过程，从而实现了高性能、高保真的显微图像去噪与超分辨重建，并结合实验室自主研发、搭建的多模态结构光照明显微镜(Multi-SIM)与高速晶格光片显微镜(LLSM)，将传统TIRF/GI-SIM、3D-SIM、LLS-SIM和LLSM的成像速度/时程提升30倍以上，实现了当前国际最快(684Hz)、成像时程最长(最长可达3小时、60,000时间点以上)的活体细胞成像性能，首次对高速摆动纤毛(30Hz)中转运蛋白(IFT)的多种运输行为以及完整细胞分裂过程中核仁液液相分离(liquid-liquid phase separation)过程进行快速、多色、长时程、超分辨观测。Nature Biotechnology针对这一工作同时发表了评述文章(Research Briefing)。 　　具体而言，李栋/戴琼海研究团队提出的合理化深度学习结构光超分辨重建架构(rDL SIM)不同于现有超分辨神经网络模型的端到端(end-to-end)训练模式，而是采用分步重建策略，首先利用所提出的融合成像物理模型和结构光照明先验的神经网络对原始SIM图像进行去噪和高频信息增强，然后通过经典解析算法进行SIM重建以获得最终的超分辨图像。相比于该团队去年在Nature Methods上提出的超分辨重建神经网络模型DFCAN/DFGAN，rDL SIM可将超分辨重建结果的不确定性降低3~5倍，并实现更高的保真度和重建质量；相比于其他去噪算法(如CARE)，rDL SIM可恢复出调制在原始图像中的莫尔条纹，并将高频信息增强10倍以上。 　　此外，针对晶格光片显微镜、共聚焦显微镜等宽场照明或点扫描成像模态，该团队提出了一种可学习的傅立叶域噪声抑制模块(FNSM)。该模块可以利用OTF信息对显微图像中的噪声进行自适应滤除。科研团队以此构建了嵌入FNSM的通道注意力去噪神经网络架构，并基于显微成像数据本身的时空连续性，提出了时空交织采样自监督训练策略(TiS/SiS-rDL)。该策略无需额外采集训练数据、亦无需保证时序数据具有时间连续性，即可实现媲美监督学习效果的去噪神经网络的训练，解决了实际生物成像实验中高质量训练数据难以获取的难题。 　　合理化深度学习超分辨显微成像方法可适用于包括2D-SIM、3D-SIM、LLSM等在内的多种显微成像模态，提供高分辨率、高保真的显微图像重建性能，相较于传统方法最多可以提升30倍的成像时程和10倍的成像速度。借助rDL成像技术，研究团队开展了诸多过去的成像手段无法开展的超分辨活体成像实验，并与Lippincott-Schwartz、中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员朱学良、中科院遗传与发育生物学研究所研究员何康敏探讨了其潜在的生物学意义，包括：对滴落在玻片上的U2OS细胞贴壁生长过程进行双色、长时程(1小时以上)、超分辨(97nm分辨率)观测，清晰、真实地记录了细胞粘附和迁移的动力学现象，且不干扰这一漫长、脆弱的生命过程；对高速摆动纤毛以当前最快的684Hz成像速率进行长达60,000个时间点的连续超分辨观测，且过程中无明显光漂白或细胞活性损伤，并对纤毛摆动模式和频率进行统计分析；对摆动纤毛及纤毛内转运蛋白(IFT)进行超快、超分辨双色成像，揭示了IFT在行进途中碰撞、重组、掉头等多种新行为；通过对cCAS-DNA与ER进行双色、长时程、超分辨成像，观测到cGAS-DNA在保持与ER持续接触过程中的定向运动、转向或扩散等行为，拓展了对膜性细胞器与无膜细胞器相互作用机制的认知；对HeLa细胞分裂过程中的核仁磷酸蛋白(NPM1)、RNA聚合酶I亚基RPA49及染色质(H2B)进行超长时程(12秒采集间隔，2.5小时以上)的三维超分辨活体成像，实现了对完整有丝分裂过程中NPM1与RPA49两种结构形态变化的三维超分辨活体连续观测，揭示了细胞有丝分裂过程中核仁形成以及NPM1、RPA49两种无膜亚细胞结构的相变、互作规律；以10Hz的全细胞体成像帧率对高尔基体进行长达10,000时间点的连续拍摄，并实现了对完整细胞分裂过程内质网、溶酶体、线粒体等亚细胞结构的三色、高速(秒量级)、超长时程(小时量级，1000个时间点)三维观测，探究了细胞有丝分裂过程中细胞器在子代细胞中的均匀分配机制。 　　李栋/戴琼海合作团队通过人工智能算法与光学显微成像技术的交叉创新，提出了合理化深度学习超分辨显微成像框架，解决了现有深度学习成像方法分辨率损失、预测不确定性、训练集不易采集等难题，可为多种活体显微成像模态提供30倍以上的成像速度与时程的提升，为细胞生物学、发育生物学、神经科学等领域的发展提供了重要的研究工具。同时，该研究团队所坚持和倡导的人工智能算法与光学成像原理交叉创新、软硬结合的研究思路，为现代光学显微成像的发展开辟了新的技术路径。 　　研究工作得到国家自然科学基金、科技部、中科院、中国博士后科学基金、腾讯“科学探索奖”、清华大学“水木学者”计划的支持。图1.合理化深度学习超分辨显微成像神经网络架构图2.合理化深度学习超分辨显微成像方法应用概览