成本估算

寡核苷酸分离技术合成寡核苷酸和DNA片段被应用于迅速发展的应用领域，包括作为主体或杂交探针用于治疗性制剂。沃特世寡核苷酸分离技术(OST：Oligonucleotide Separation Technology)基于BEH杂化颗粒的反相色谱柱，以及Gen-Pak离子交换柱，应对各种高分辨分析与实验室规模分离挑战所需，包括涉及各种DNA和RNA品种。沃特世OST色谱柱装有键合了C 18 的第二代杂化技术BEH颗粒。对去三苯甲基(detritylated，或称脱保护)的合成寡核苷酸样品的分离，基于成熟的离子对反相色谱法。沃特世提供1.7 μm UPLC颗粒或2.5 μm HPLC颗粒，装填以各种不同色谱柱规格，从而灵活满足各种实验室规模分离或分析的不同需求，并能实现异乎寻常的样品分辨率和卓越的色谱柱使用寿命。此外，沃特世的制造和质控测试程序，有助于确保批次之间与柱之间的性能的一致性，而无论应用的难度有多高。1、分离效率相当于或优于PAGE、CGE、或离子交换HPLC方法2、可从去三苯甲基(脱保护)的全长产物中分辨出失败序列3、可放大的柱规格，满足实验室规模的分离需求4、超长的色谱柱使用寿命，降低单次分析或分离成本5、经MassPREP OST标准品质控测试，帮助确保性能稳定对寡核苷酸混合物具有异乎寻常的高分辨率ACQUITY UPLC OST C 18 ，1.7 μm色谱柱(设计专用于ACQUITY UPLC系统)和XBridge OST C 18 ，2.5 μm色谱柱，能完全适用于离子对反相色谱法分析和纯化去三苯甲基寡核苷酸的需求。如图所示(右图)，使用沃特世UPLC技术所进行的分离，具有与毛细管凝胶电泳(CGE)相媲美的组分分辨率，而且分析时间显著缩短。由于使用亚2 μm BEH技术颗粒提高了分辨力，因而有可能对大寡核苷酸序列进行分离(如将N与N-1分开)。此外，使用沃特世OST色谱柱配合质谱联用技术以及对质谱兼容的洗脱剂，有可能对与失败序列的色谱分离开的目标寡核苷酸产物的分子量特征进行定量分析。分离15-60mer去三苯甲基寡脱氧胸苷序列组(Detritylated Oligodeoxythymidine Ladder)分离去三苯甲基寡脱氧胸苷序列组，比较毛细管凝胶电泳(CGE)与离子对反相色谱方法的分离效果纯化单链RNA干扰RNA寡核苷酸的UPLC/MS分析RNA干扰(RNAi)机制的发现现在被广泛用于静默目标基因表达，这推动了对小分子干扰RNA(siRNA)分析的需求。为满足对20-25个核苷酸的小分子干扰RNA(siRNA)进行耐用的、快速的、灵敏的分析的需求，沃特世开发了一个UPLC/MS方法，运用了UPLC OST色谱柱和Synapt HDMS质谱仪。采集准确质量可对5’-截断寡聚体(寡核苷酸合成过程所产生的失败序列)以及其它一些杂质峰进行分配。质谱图中的质量的每个峰均使用MaxEnt 1软件进行去卷积化。图2给出了推测性的5’-端失败产物。对寡核苷酸母体的几乎完整序列均进行了解释。质谱分析还显示除了目标21-mer RNAi序列以外，还存在一个额外的尿苷单核苷酸。对一个21mer的RNA进行LC/MS分析不同离子对试剂对不同寡核苷酸序列分离的影响杰出的柱寿命在这些苛刻的分离条件下，填充以BEH技术颗粒的沃特世OST色谱柱显示出引人注目的柱寿命，同时还具有并保持卓越的分离性能。而在相同的苛刻分离条件下，传统硅胶基质色谱柱的使用寿命显著缩短。分离5-25mer去三甲苯基(脱保护)寡脱氧胸苷序列——进样1000针柱分辨率没有任何变化寡核苷酸分离技术(OST)柱产品一览表产品描述 粒径 孔径 柱规格 部件号ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 50 mm 186003949ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 100 mm 186003950ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 150 mm 186005516ACQUITY UPLC OST C 18 方法验证包** 1.7 μm 135 2.1x 100 mm 186004898ACQUITY UPLC OST C 18 定制柱* 1.7 μm 135 定制 186003951XBridge OST C 18 2.5 μm 135 2.1 x 50 mm 186003952XBridge OST C 18 2.5 μm 135 4.6 x 50 mm 186003953XBridge OST C 18 2.5 μm 135 10 x 50 mm 186003954XBridge OST C 18 方法验证包** 2.5 μm 135 4.6 x 50 mm 186004906XBridge OST C 18 定制柱 2.5 μm 135 定制 186003955* 用于配合沃特世UPLC系统使用**来自于不同批次填料所装填的三根色谱柱可放大的DNA与RNAi分离，良好的产品回收率研究基因静默、或用于基因敲除时，需要高纯度寡核苷酸。XBridge OST C 18 色谱柱，具有极高分辨率，其柱规格设计用于满足实验室规模的分离需求，是纯化去三苯甲基(脱保护)寡核苷酸的首选色谱柱。如下表所示，XBridge OST C 18 色谱柱规格和操作流速的选择，主要取决于合成反应混合物的规模大小。我们建议根据寡核苷酸样品的载量选择适当的色谱柱规格，这样可使组分分辨率最大化，使目标产物与不要的失败序列分离开得到最大回收率。柱规格 大概样品载量** mg*** 流速2.1 x 50 mm 0.04 μmoles 0.2 mg 0.2 mL/min4.6 x 50 mm 0.20 μmoles 1.0 mg 1.0 mL/min10 x 50 mm 1.00 μmoles 4.5 mg 4.5 mL/min19 x 50 mm* 4.00 μmoles 16.0 mg 16.0 mL/min30 x 50 mm* 9.00 μmoles 40.0 mg 40.0 mL/min50 x 50 mm* 25.00 μmoles 110.0 mg 110.0 mL/min* OST订制柱** 所列数值仅为约值，且取决于寡核苷酸的长度、碱基组成、以及所采用的“切取中心”的馏分收集方法。*** 按平均寡核苷酸分子量及合成产率估算将siRNA Duplex与其相关杂质分离开

沃特世OBD色谱柱设计沃特世已将高压匀浆填充与经过仔细计算的轴向压缩因素相结合，应对于柱头装填密度较小的部分。按照制备柱OBD设计理念，并按每种填料类型和每种柱规格的立体几何学加以精心微调的实际操作工艺，就可以获得可预测的、对整个柱床长度都均匀一致的装填密度。在装填结束后的封柱过程中，沃特世柱装填操作依从仔细严格的操作流程，从而确保不会以任何不均匀的方式过度压缩或扰动柱端部分。OBD制备柱硬件设计包括一对精心设计的分流板和化学惰性密封圈，以防止在高压操作下出现漏液情况。OBD制备柱装配件图解OBD空柱部件分解图优化的OBD制备柱技术确保柱效更高OBD制备柱计算器设计用于简化常规制备计算：1、柱/管路背压2、样品载量放大3、梯度流程放大4、梯度设计可直接放大—准确可靠的表现分析柱的分离效果纯化工作者大都遇到这样的情况；即使使用和分析柱完全相同的填料颗粒，色谱分离往往也不能“直接放大”，总是会出现分离度降低或上样量下降的问题。OBD制备柱的柱床密度与分析柱相当，具有优异的稳定性、重现性和柱效，能够保证分离的直接放大，并避免在制备分离时重新开发方法。更长和可预测的制备柱寿命采用反相技术进行分离，组成复杂的待分离粗品经常需要用强溶剂如DMSO进行溶解，由于粗品在流动相中的溶解度低，加上大体积纯有机溶剂进样对制备柱产生的压力冲击，是导致制备柱过早失效和柱床塌陷的主要因素。OBD制备柱具有极佳的柱床稳定性，根本不会塌陷，而且柱与柱间性能完全一致，使用寿命大大延长，从而降低了使用成本。来自药物开发实验室的数据：在一根XBridge C 18 ，5μm 19×50mm OBD制备柱上进样7000次的结果从分析柱到制备柱直接放大，常用计算公式：流速可用于计算与分析柱应用时完全相当的线性流速条件下对应于更大色谱柱的体积流速。但是，合理的流速将取决于柱规格。当柱长增加、粒径减小时，柱背压会相应增加，会受到液相系统耐压性的限制。梯度持续时间估算：制备柱上样量预估对于OBD制备柱的大概上样量(毫克)，梯度洗脱模式时：1 合理流速取决于柱内径。随柱长增加及填料粒径减少，柱背压增大，使用时会受到液相设备的耐压性的限制。在制备柱上的梯度持续时间，应按照与分析柱应用时相等的梯度洗脱体积与柱体积之比的倍数因子计算(计算公式见“梯度持续时间估算”公式)。2 此处进样体积数值基于50mm柱长并使用较强溶剂溶解样品时。如增加柱长，进样体积亦可增加，但并不成正比。使用较弱强度的溶剂溶解样品，能显著提高进样体积量。制备柱的样品载量受制于许多因素。以上所列数据仅为“平均状况下”的预估值。通常规律有：1、强保留的目标物载量较大2、样品简单时载量较大3、需要高分辨时载量降低4、样品载量受上样条件影响很大：（1）受限于样品体积（2）受限于样品溶剂的强度5、对于肽样品，其载量主要取决于目标肽序列以及肽样品的溶解性，建议按所列值的5-20%预估。

想要成功分离脱三苯甲基、去保护的寡核苷酸，您需要具有高分离能力并且可以耐受严苛条件的色谱柱。如果色谱柱不具备足够高的分离能力，则不能保证结果的准确性。如果色谱柱不够稳定，则需要频繁地进行更换，这样便会扰乱工作流程，从而增加成本。Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱拥有高效的 2.7 µm 表面多孔 Poroshell 颗粒填料。采用安捷伦独有的技术对颗粒填料进行化学修饰，使其可耐受高 pH 的流动相。我们还将这些填料与封端 C18 固定相键合，从而为寡核苷酸的分析提供出色的选择性。此外，我们还采用分离度标准品对每一批 AdvanceBio 寡核苷酸填料进行了测试，确保其具有一致的性能。AdvanceBio 系列产品旨在为蛋白质、抗体、偶联物、新生物实体和生物药物的完整表征提供一致、卓越的性能。