纳米孔测序

即插即用型的测序仪。科研人员们很快就可以用到这种便携式的DNA测序仪了。 美国佛罗里达州的Marco岛（Marco Island, Florida）是基因组测序者们的圣地，十几年来，这里每年都会举行一次基因组测序盛会，全世界的基因组测序仪制造商们都会在会上拿出他们最先进的技术 和产品，其中有很多都是革命性的创新技术。最近最吸引人的就是英国牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）在两年前发布的技术，他们能够进行实时测序，而且拥有非常长的读长，这项技术只需要让待测DNA分子通过一个纳米级的孔道就行 了（Science, 4 May 2012, p. 534），在此之前很多人都认为这是不可能完成的任务。牛津纳米孔技术公司表示他们会尽快推出原型机，让广大科研工作者都享受到技术进步带来的便利。 经过了两年多的沉寂，他们最终给出了答卷。虽然该公司并没有派人参加这次的大会，但是据一位与该公司有合作的科研人员介绍，他们已经用这种新技术对 一种细菌进行了基因组测序，而他本人也使用测序结果组装出了细菌的完整基因组序列。并且牛津纳米孔技术公司也在积极兑现承诺，通知科研人员们对他们的新设 备进行测试。不过并不是所有人都认可该公司的这第二步棋，因为他们得到的测序数据的质量并不高，单单靠这些数据是不可能获得完整基因组序列的。 与此同时，传统的测序仪也在飞速地发展，希望进一步降低测序服务的成本。比如全世界最大的测序仪制造商Illumina公司就在今年1月登上了头 条，因为他们宣称将推出一台新产品，能够将个人基因组测序的成本降低到1000美元这个具有重要意义的分界线，因为很多人都认为如果个人基因组测序的费用 能够降低到这个水平，将使测序成为一项临床常规检测手段（Science, 17 March 2006, p. 1544）。 Illumina公司推出的这台新设备与其它新一代测序仪（next-gen sequencers）一样，采用的也都是合成测序策略，即在新DNA链合成的时候检测出被添加上的碱基。这些碱基必须加上化学标签（修饰物），以方便辨 认。采用这种技术测得的片段读长都很短，需要进行后续拼接。而牛津纳米孔技术公司采用的测序策略则完全不同，他们使用的是实时测序方法，让一根DNA长链 穿过纳米级别的孔径来完成测序。当DNA链上的碱基通过纳米孔时，它们会阻断纳米孔中的离子流，而每一种碱基引起的变化都不相同，因此就可以判断出碱基的 序列。从理论上来说，这种技术的测序读长可以达到数千bp，不会产生延迟，也不需要进行事后的序列拼接。这项技术提出距今已经过去了接近20年，最终于 2012年成为了现实。当时牛津纳米孔技术公司提交了一份病毒基因组序列，据称就是使用纳米孔技术测得的。 但为什么后来就没动静了呢？ 基因组测序成本经过了多年的下降，目前已经达到了一个平台期，不过也有可能会继续跳水，如图中虚线所示，只要Illumina公司宣传的1000美元个人基因组测序目标能够实现。（M：百万美元 K：一千美元） 据牛津纳米孔技术公司介绍，这两年来他们一直在寻找一种新型的基质膜来为纳米孔提供支撑，因为最开始使用的基质膜不适宜进行大规模制造。他们也调整 了产品开发策略，放弃了最开始计划的大型测序仪开发计划，转而投向开发小型手持式、一次性测序设备，因为他们感觉这块市场需求更大。 美国马萨诸塞州博大研究所（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts）的David Jaffe在今年也透露一些新进展。他们课题组对大肠杆菌（Escherichia coli）这种常见的细菌和Scardovia wiggsiae（这是一种与牙齿腐烂相关的细菌）细菌进行了基因组测序，由他们提供DNA样品，牛津纳米孔技术公司完成了测序工作。这两种细菌的基因组长度分别为460万bp和155万bp。该工作表明牛津纳米孔技术公司的测序技术已经从两年前的病毒基因组水平提升到了细菌基因组水平。 但是Jaffe的内幕消息也证实牛津纳米孔技术公司还有很长的一段路需要走。该公司提供的数据证明纳米孔测序技术的确拥有相当大的读长优势，几乎可 以对一段DNA样品进行完整测序，一次最多能够得到10kb的序列。不过虽然有如此完美的数据，但是系统误差却让Jaffe等人无法将这些大片段拼接成完 整的基因组序列，而这也是纳米孔测序技术的终极目标。不过Jaffe等人发现，可以使用这些纳米孔测序数据对常见的Illumina测序仪获得的基因组序 列进行优化。美国马里兰州美国国立人类基因组研究院（National Human Genome Research Institute in Bethesda, Maryland）的Jeffery Schloss表示，虽然这种技术还处于初级阶段，但是在某些方面已经表现出了很强的应用优势。不过其他人却没有这么乐观，比如加拿大蒙特利尔麦基尔大学 （McGill University in Montreal, Canada）的基因组学家Ken Dewar就指出，如果纳米孔技术只能够对现有技术起到修补作用，那么开发一台手持式的纳米孔测序仪有什么意义呢？ 牛津纳米孔技术公司目前正在邀请科研人员们自己来验证纳米孔测序技术的实力。就在Jaffe透露消息的当天，该公司就向全世界发出了电子邮件，邀请 数百位申请者来体验他们的便携式测序仪MinION，只需要缴纳1000美元押金即可。首先这些试用者需要先用牛津纳米孔技术公司提供的DNA样品进行预 试验，熟悉仪器操作等流程，然后就可以对任意的DNA进行测序。 美国加州大学圣克鲁兹分校（University of California, Santa Cruz）的David Deamer是纳米孔测序技术的先驱，他可早就等不及了，他指出，大家可以有很多样品拿来试用。我们可要好好地&lsquo 虐&rsquo 一下这台仪器。比如有人会用来对食品 进行快速检测，看看是否存在有害微生物污染，也有人会想看看MinION能否测出古老的DNA。Deamer还想看看这台仪器是不是能够一次读出16kb 的序列。就在牛津纳米孔技术公司大肆推介这种低成本的手持式测序仪的同时，Illumina公司也没有坐以待毙，他们决定反其道而行，推出了一款专门供超大 型测序中心使用的最高级的测序仪。就在上个月，Illumina公司推出了价值数百万美元的HiSeq X，这台测序仪在一年的时间内能够测得1800个人的基因组序列，据该公司介绍，这将使个人基因组测序成本下探到1000美元以下，而且耗费的人工、仪器 折旧和试剂成本都将大幅度降低。据Illumina公司的市场部高级经理Joel Fellis介绍：&ldquo 我们看到大规模测序的需求在逐年上升。比如英国就计划到2017年时为全英国10万人进行个人基因组测序。&rdquo 不过事情可没有这么简单。任何有计划购买HiSeq X的客户必须一次订购10台以上的设备，而且必须承诺只能将这些设备用于个人基因组测序。美国加州大学圣克鲁兹分校的生物工程师Zak Wescoe表示，这已经超出了绝大部分科研人员能够承受的费用。而且这些设备只有满负荷运转时才能够将个人基因组测序的成本压低到1000美元的水平。 美国华盛顿大学基因组研究院（The Genome Institute at Washington University in St. Louis）的副主席Elaine Mardis也认为，可没有太多地方每年都能够提供1.8万人的个人基因组测序需求，也没有这么大的数据分析能力，所以Mardis这样评价道：&ldquo 我不知 道有谁会买这些测序仪。&rdquo Deanna Church是美国加利福尼亚州门罗公园Personalis公司（Personalis in Menlo Park, California）的基因组学家，他对技术进步带来的成本降低非常欢迎。他说道：&ldquo 在这块市场中将出现好几个竞争者，总有一些技术会最终胜出。&rdquo

纳米孔测序，是国际上最受人关注的第三代测序技术之一。其创新的电信号检测和单分子长链测序，让全世界的科研工作者翘首以待。做为纳米孔技术的领跑者，英国牛津纳米孔公司今年在全球选择了几家著名的实验室，测试他们的样机。我的两个朋友，一个在美国新墨西哥大学，一个在University of Queenland，分别测试了牛津纳米孔ONT。结论是：纳米孔测序尚不成熟。 　　测序长度长 　　纳米孔测序的测序最长可达到89kb，令人感到恐怖。也就是说，纳米孔测序可以一次读长就可以覆盖大部分的病毒基因组了。对于很多小基因组，连组装都省去了。纳米孔的平均读长可达4.3kb。毫无疑问这是迄今为止，所有测序仪中测序最长的。 　　测序错误率超高 　　35%，对，这就是纳米孔测序的错误率。我刚开始看到这个数字的时候，还以为看错了。但确实，平均10个碱基，就有3.5个测序错误。其中3%的插入错误，16%的删除错误，16%的错配。高达35%的错误率，意味着基因突变检测成为纳米孔测序的禁区，也成为纳米孔测序的致命弱点。 　　当前的纳米孔测序未来有可能在哪些领域有优势呢?1，在细菌和病毒等病原体检测方面，纳米孔测序可以无需组装就可以得到全基因组。2，利用长度长的优势，和二代测序结合，协助组装基因组。 　　最后，我画了一张图，来比较目前的三个第三代测序技术。 　　很明显，测序最准确的是Helicos平台，测序最长的是Nanopore。三代测序要成为一个成熟的，可以在临床广泛使用的技术，还需要数年的优化和提高。 作者：贺建奎

p /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/uepic/1912aaae-6c47-454e-9f5f-1d6a5c9540a3.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center TEXT-INDENT: 2em" Scott Tighe（左）等研究人员利用MinION设备在南极泰勒谷测序微生物DNA。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center TEXT-INDENT: 2em" 图片来源：Sarah Johnson /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" Christopher Mason有一个喜欢在会议上展示的技巧。通过从志愿者手机上收集的化验样本获取DNA，他和同事能在一个小时内现场进行谱系分析，甚至详细描述出捐赠者一天的生活细节。“我们能从手机上的残留物预言谁刚吃了一个橘子或者谁吃了猪肉。”美国纽约威尔康奈尔医学院计算生物学家Mason表示。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 他通过利用一种由英国牛津纳米孔技术公司（ONT）研发、名为MinION的手持测序设备实现了这种快速分析。MinION会让DNA长链穿过被称为纳米孔的小孔，并且探测由DNA的4个核苷酸组件引发的电流微小变化，从而阅读序列信息。虽然Mason的展示是对该设备性能的轻松说明，但早期用户也积累了一些引人注目的科学成就。MinION在监控2015年埃博拉病毒爆发上扮演了举足轻重的角色，乘船到达过南极甚至进入了太空轨道。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 不过，大小和一幅扑克牌相当的MinION仅在全球测序市场上占据了一小部分份额。这个市场仍由位于加州圣地亚哥的启迪公司主导。虽然启迪领先了近10年，但ONT及其用户也正在努力克服技术挑战——最突出的挑战是较高的出错率。与此同时，竞争的企业希望对这种概念上很简单但技术上很复杂的测序策略稍加创新，从而超越ONT。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" strong 在传染病研究人员中最受欢迎 /strong /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 事实证明，MinION在传染病研究人员中尤其受欢迎。例如，伯明翰大学微生物基因学家、MinION早期采用者Nicholas Loman同全球病毒“热点区域”的同行合作，共同监控埃博拉在西非以及寨卡在巴西的传播。“他们基本上能在48小时内建立一个测序实验室并使其运行，并且可以把设备打包装到能携带的行李箱里。”加州大学生物物理学家Mark Akeson表示。Akeson开展了纳米孔测序法方面的一些基础性研究，并且是ONT咨询委员会成员。Loman表示，这种可携带性是一种巨大的优势，但大量的数据输出可能会难以掌控。“我们在巴西几乎要成功了，但因为设备过热，我的苹果电脑崩溃了。” /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 一些团队正在探寻临床微生物学应用。澳大利亚昆士兰大学生物信息学家Lachlan Coin开发了实时数据分析算法，以便检测血液样本中的耐药细菌。在利用培养细菌开展的早期测试中，Coin团队能在10个小时内辨别出一个样本中的所有抗药基因。Coin介绍说，现在的技术能让这一时间减半，但利用真实样本（人类DNA会将细菌DNA淹没）的做法正在令这一过程复杂化。“我认为，再过一年左右，我们将能在6个小时内辨别出病人样本中的抗药基因。” /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 其他研究人员正在探寻宏基因组学，目标是全面描述样本中的所有生物体。原则上，流动细胞中的每个纳米孔都能被用于同时检测不同的基因组。“你可以获得存在的任何物种——细菌、病毒和人类DNA的完整基因图谱。”Mason介绍说。他利用纳米孔测序对因肮脏出名的纽约地铁系统开展了宏基因组学调查，并且雄心勃勃地计划对更加荒凉的环境——包括火星进行分析。Mason同美国宇航局的科学家合作证实，MinION在国际空间站零重力条件下表现良好。他和同事希望，有一天能将该技术用于研究火星，并且为正在进行的寻找地外生命提供帮助。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 回到地球，佛蒙特大学遗传学家Scott Tighe在南极麦克默多干河谷运行了MinION。在那里，他的团队用了两个多小时对微生物样本进行了测序。“设备停止运行的原因在于外面太冷了：电池到最后没电了。”同Tighe就若干项目有过合作的Mason解释说。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" strong 瞄准哺乳动物基因组 /strong /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 诸如美国国家人类基因组研究所所长Adam Phillippy等纳米孔方面的资深专家将微生物基因组组装视为“一个已经解决的问题”。如今，他们有了更高远的目标：含有数十亿个而非几百万个核苷酸的哺乳动物基因组。今年，一个包括Phillippy、Loman和加拿大安大略癌症研究所生物信息学家Simpson在内的研究团队报告称，他们仅利用达到很高准确度的MinION数据便组装了完整的人类基因组。Simpson介绍说，平均的重叠群大小达到百万碱基级别，精度值最高为99.44%。搭配使用启迪公司的短序列技术，该团队将准确度提升至99.96%，尽管这仍落后于99.99%的金标准准确度。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 不过，在人类基因组分析的其他方面，纳米孔要更加擅长。例如，目前的人类基因组组装仍不完整，因为高度重复的区域对短序列分析“并不感冒”。一个由加州大学基因组学研究人员Karen Miga领导的团队证实，纳米孔能帮助研究人员填补这些空白。Miga团队利用150千碱基对序列重构了人类着丝点，即真核生物染色体上高度重复的基因组。对该领域的研究此前是一片空白。同Miga开展合作的Akeson预测，离组装出真正完整的基因组序列可能仅有几年时间。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 纳米孔分析还非常适合绘制外基因标记——对单个核苷酸进行的微小化学修饰，会影响基因表达。大多数测序平台利用的是清除这些标记的样品制备方法，但纳米孔平台可直接分析修饰的DNA。Simpson和来自约翰斯· 霍普金斯大学的Winston Timp证实，他们能训练软件区分甲基化胞苷酸和正常胞嘧啶的电信号，准确度约为90%。Akeson也实现了类似的成功。“我们能探测到任何试图看到的修饰。”Akeson表示，“它甚至能区分两个氢原子之间的差别。” /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" strong 更多期待 /strong /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 不过，一些用户发现，纳米孔样本准备工具具有不可预知性。例如，一些DNA样本需要广泛的优化。“一些人做得非常好并且获得了惊人的成果，但其他人仍在挣扎。”位于马萨诸塞州的药物研发公司Warp Drive Bio首席科学家Keith Robison 表示。在去年12月的一次演讲中，ONT首席科技官Clive Brown宣称：“公司正在投入很多努力，为人们提供针对特定样本类型的调试协议，从而帮助他们优化获得的样本。” /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 诸多问题为竞争者带来了机遇。跟得最紧的是位于瑞士的罗氏公司。2014年，该公司并购了总部位于加州的纳米孔初创企业——珍妮亚技术公司。虽然罗氏公司对它的系统秘而不宣，但珍妮亚公司在2016年公开的一份文件中描述了“通过合成开展纳米孔测序”的策略。该技术将DNA合成酶同蛋白纳米孔配对。这种酶会读取目标DNA，并且利用带有化学标签的核苷酸建立互补序列。在每个碱基被包括进不断延长的DNA链时，它的标签被释放并穿过纳米孔，从而产生不同的电信号。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 不过，ONT并未止步不前。和此前的模型相比，其两个最新的桌上型系统能传送大很多的数据量。在今年3月发布的GridION基本上可并行运行多个MinION设备。相比之下，PromethION利用的是一种完全不同的流动细胞，并且面向的是人类基因组规模的项目。“很明显，他们想让该系统在输出量方面同启迪公司的平台相媲美。”Loman表示。 /p p style=" TEXT-INDENT: 2em" 虽然该领域取得了很多进展，但不容否认，纳米孔测序占据了支配地位。其低成本、可靠测序的前景令研究人员兴奋不已。“作为计算机科学家，我总是非常渴望数据。”Phillippy表示，“所有微生物学实验室和大学课堂都能产生测序数据的想法非常诱人。”& nbsp /p