中药代谢组学

走近“中药代谢组学研究平台” ——访沃特世用户黑龙江中医药大学王喜军教授 　　代谢组学是上世纪九十年代中期发展起来的一门新兴学科，是系统生物学的重要组成部分。研究中药这种成分复杂的混合物，代谢组学是最好的选择。同样，代谢组学也是中药质量控制的主要研究手段，有利于中药的出口和国际化。 　　根据代谢组学发展的要求，沃特世公司与代谢组学创始人Jeremy Nicholson教授合作，首创全球领先的超高效液相色谱UPLC技术，与高分辨质谱技术和计算技术结合，推出了以超高效液相色谱/高分辨质谱联用仪为代表的中药代谢组学研究平台。 　　2010年3月24日，仪器信息网受沃特世公司之邀，专访了沃特世中药代谢组学研究平台用户——黑龙江中医药大学王喜军教授，其结合科研实践中的使用感受，详细介绍了沃特世中药代谢组学研究平台具体应用情况。 　　Instrument：请简要介绍下目前您在中药代谢组学方向的研究课题以及所取得的科研成果。 　　王喜军教授：首先，我最开始的科研方向是天然产物及复方中药的体内代谢，即 “中药血清药物化学”。“中药血清药物化学”是在九七年提出来的，并于2002年获得了国家科技进步二等奖。在“代谢组学”概念提出后，我就将代谢组学和中药血清药物化学结合起来研究中药方剂的问题，在此基础上进一步提出了新的学科——中医方剂药物代谢组学。同时，我将自己所研究的课题与代谢组学“嫁接”在一起开展了中医症候本质研究。我们承担的国家973项目“基于体内直接作用物质的方剂配伍规律研究”也已经顺利结题。 　　Instrument：据悉，黑龙江省中药材GAP研究中心作为全国第一家GAP专业研究机构，是由王教授您组织建立的，请您谈谈该中心的成立背景及其主要工作内容。 　　王喜军教授：该中心是在“九五”末期“中药现代化研究及产业化行动”背景下建立的，这个主题就是要开展中药资源再生，实现可持续化发展。如果要进行中药材大面积有效生产，就要建立药材生产质量管理规范即所谓的GAP。实际上GAP是一个大概念，真正的GAP就是每种药材生产过程中的SOP(标准操作规程)。 　　该中心主要工作内容就是把黑龙江地道药材按GAP要求进行管理，但这就需要一个专业团队来进行具体研究，以获得相关的实验室试验数据做支撑。黑龙江省中药材GAP研究中心成立后已经先后完成八种黑龙江省的地道药材的GAP研究工作。此外，该中心还解决了中药材大面积生产过程中病害的无公害防治技术，提出了以中药治疗药用植物病害的理念，结束了中药只治疗动物和人类疾病的历史。GAP研究使得中药材生产由农民散在的经验模式种植，进入了科学管理规范状态。 　　Instrument：请问贵单位在科研工作中主要用到什么分析仪器?其中哪些属于沃特世“中药代谢组学研究平台”的产品?这个平台对您的科研工作起到了怎样的支撑作用? 　　王喜军教授：中药学是一门综合学科，我主攻体内分析方面的研究，所以分析仪器设备是非常关键的一个环节。目前科研工作中我们主要用到UPLC® 、Q-TOF、SYNAPT™ HDMS 、GC-MS等，另外还包括一些常规分析仪器，比如紫外分光光度计以及PCR等一些分子生物学仪器，其中大部分分析仪器都是沃特世产品。 　　由于我的专业是生药学，所以科研研究的核心还是药材品种质量。虽然一般分析仪器都能满足日常科研需要，但是不同分析仪器做出来的效果还是有差别的。如果科研需要更高要求的数据，那就对分析仪器质量性能提出了挑战。根据多年来使用感受，我认为沃特世公司的仪器在检测分辨率以及后期数据处理的工作站等方面都是不错的。 　　中药学无论是质量、活性成分研究以及效应评价，都不能以一种先入为主的态度去研究，而是需要先更多地去认识中药，然后才能更好地解析中药。如果一种仪器设备或手段能够提供更多的信息来让我了解中药，这个仪器可能就是比较好的。只有深入认识中药之后，才可能产生新的思路去研究它。而UPLC就提供了这样一个平台，可以让研究人员在短期内了解被分析样品大量的信息，提供良好数据支持新的思维。沃特世最早推出UPLC/ Q-TOF，它在使分离时间缩短的同时检测分辨率也相应提高，能够更快更好地检测出更多的被测成分。九十年代初，能够鉴定血清中三、五个成分就已经很不错了，而现在已经可以鉴定出四、五十个成分 当时需要用两小时进行分析检测，而现在可能只需要十分钟，这就是UPLC/Q-TOF的优势所在。 　　Instrument：据了解，王教授您最早购买了一台Q-TOF Micro质谱仪之后又购进一台SYNAPT HDMS质谱仪，请问是因为您所做的研究必须同时购置这两种仪器吗?这两种仪器对您的研究都有哪些帮助? 　　王喜军教授：因为我个人比较关注新技术、新产品，所以沃特世推出新品之后，我就希望了解新品的优势能具体解决科研中什么问题。比如SYNAPT™ HDMS质谱仪采用四极杆-离子淌度-飞行时间串联之后，与单纯Q-TOF相比，除了具有常规质谱仪按质量/电荷比分离的功能外，还能按照被检测物离子尺寸和形状来分离化合物。对于中药复杂成分来讲，有可能分开传统质谱不能分开的同分异构体分子，这无疑使得检测范围扩大，灵敏度提升。我在科研工作中使用SYNAPT HDMS，就是期望有可能开辟一个新的科研方向。 　　在已有仪器设备所限定的思维模式下，需要换一种新方法、新手段从而产生新的突破。人的思维与其知识积累、掌握的材料有关，一种新仪器提供的数据很有可能改变既有思维模式。例如我们目前所做的刺五加不同花丝长度的分析就采用这台质谱仪，它解决了科研过程中一些检测上的问题，包括后期多级分析。 　　Instrument：作为沃特世“中药代谢组学研究平台”的用户，您能否评价一下沃特世公司产品的性能以及该公司的售后服务? 　　王喜军教授：我在日本读博的时候就开始使用沃特世仪器，当时我们实验室里很多液相色谱仪都是Waters 990，所以对沃特世产品印象很深。我回国后留校从事科研教学工作，学校非常支持我的科研工作。根据我在日本留学时候的体会，建议学校购进了两台Waters 2996。随着沃特世仪器的不断升级以及研究领域的开拓整合，包括后期推出的中药代谢组学平台，逐渐引起我极大的兴趣，所以我在深入了解沃特世产品之后，决定将UPLC以及SYNAPT HDMS 和代谢组学软件MarkerLynx™ 引进来，用于我所从事的中药研究，以期待解决很多分析检测方面的问题。关于这部分，还需要提及了软件处理方面的重要性，一个应用平台要成功除了系统的硬件组成部分要过硬之外，很大程度上还取决于其软件支持方面 ，沃特世公司除了在硬件的稳定性、灵敏度方面不遗余力之外，还开发了配套的软件程序以帮助用户从复杂的质谱图中快速智能地查找出具有生物意义的标记物。例如，目前我们进行的疾病模型、方剂的配伍规律以及中药材基源物质的遗传多样性表型分析等方面研究都在使用这个中药代谢组学平台。 　　我经常给学生讲，无所谓什么好的手段或好的仪器，能解决问题的就是最好的。我需要质谱与前端分析仪器有效的整合成一种平台，在短时间内使得相似有效成分分离然后才能去检测。我之所以选择沃特世产品，就是因为其产品整合的比较好。其实从目前来讲，各种品牌的质谱仪之间的差别已经不是很大了，而如何将前端的分析仪器和后端的检测仪器有效地整合起来，使得从分析检测数据的采集到后期工作站数据的处理有效连贯起来，这就对不同品牌的仪器提出了较高的要求。不同研究课题之间的联系、通用、互用、整合，就要求检测仪器以及研究方法的一致性，检测手段连贯性、统一性、承接性。而沃特世产品很好的做到了这一点，所以我一直很信赖他们的产品。 　　我非常关注仪器的维修及时性问题。因为仪器使用过程中不可能预测何时会出现故障，何时需要维修，一旦出现故障，就需要维修或者及时更换零配件，否则仪器“停”了，整个研究工作也就停滞了。再加上我们所做的大部分都是生物样品，即使有低温冰箱也不行，很多成分还是在变化，这对科研项目来讲是非常致命的。不过通过与沃特世长期合作以及与其高层的沟通之后，这些问题目前解决的还是不错的，令人满意。

p 　　我们实验室近年来建立了基于代谢组学策略的药物代谢动力学新方法，在分子水平上刻画包括复方中药和天然产物在内的多成分药物（Multi-component Agents）在体内的整体、动态的代谢和相互作用过程。最近与上海中医药大学刘平教授团队合作，采用高通量代谢组学平台以及所建立的多组分药物生物信息学数据分析手段，开展了复方中药黄芪汤的药物动力学研究，结果于2017年7月4日在线发表于国际药理学期刊 Clinical Pharmacology & amp Therapeutics。 br/ /p p 　　药物动力学（pharmacokinetics, PK）是表征药物分子在生物体内随时间变化的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）规律的方法。由于化学成分组成的复杂性以及在生物体内发挥药效成分的多样性，包括复方中药在内的多成分药物的代谢动力学研究一直以来是一个“瓶颈”。 /p p 　　这种技术和方法学的“瓶颈”包括：（1）缺乏整体性，以偏概全地将一种或数种成分来代表和预测包含了成百上千个化学成分的复方药物系统；（2）缺乏动态变化，只关注药物原型分子的数据而不涉及药物互相作用以及药物分子的体内代谢全过程；（3）缺乏生化效应的信息，只关注药物分子的化学变化而没有生物体对药物的代谢反应信息。 /p p 　　复方中药在体内的ADME是一个多成分化学系统和一个多层次多靶点的生物系统之间的相互作用过程，这个复杂的体内过程无法在还原论的思维下用一个或几个药物成分来简单还原。由于无法在理论和方法学上突破现有的瓶颈，目前定量检测单一化合物的药物PK方法很难真正描述中药整体性和动态性的体内代谢状况。因此，复方中药作为一个“黑箱”，其体内过程一直以来无法得到客观性的评价，用简单的还原方法得出的结果无法真正体现中医方剂配伍下具有协同效应的复方中药的临床价值。 br/ 　　2010年的时候，我与四川大学华西药学院的兰轲博士合作（有意思的是我们俩是通过科学网认识的），共同提出了一种采用代谢组学方法同时监测多成分药物动力学的新策略—我们称之为“多药药物动力学Poly-PK （poly-pharmacokinetics）”。 /p p 　　这个新思想利用代谢组学技术，对药物自身的化学成分、体内产生的次级代谢成分，以及生物体的内源性的代谢物三组变量同时进行定性和定量检测，联合生物信息学方法对所获得的数据进行差异性和关联性的分析比较，获得远远多于传统药代动力学方法所能得到的药物代谢信息，体现复杂药物整体成分的代谢效应。 /p p 　　在这种新的研究策略下，我们于2012年将Poly-PK成功应用于普洱茶对人体代谢影响的研究，初步验证了其有效性和可行性。2015年应邀在Science杂志有关传统药物研究的副刊上撰文总结了多成分中草药体内Poly-PK的新策略。 br/ 　　最近，我们与正在开展复方中药黄芪汤I期临床研究的刘平教授团队合作，对健康志愿者服用中药黄芪汤（含黄芪和甘草两味药）前后药物的多种化学成分在体内的吸收、代谢过程、以及对机体代谢网络的影响进行了系统研究。 br/ /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/9541b4b8-ef6d-4598-854d-ba369ad3f4d5.jpg" title=" 1.jpg" / /p p br/ /p p style=" text-align: left " 　　研究结果显示黄芪汤包含有84种不同的化学成分，服药前志愿者体内被检测到292种体内代谢物，服药后则被检测到有532种代谢物。对服药前与服药后各时间点的代谢物分析比较，发现其中有485种代谢物发生变化，并且这种变化与服用黄芪汤有关。经生物信息学分析得知，黄芪汤中有56种成分是以原型成分形式被吸收进入血液，还有292种新成分（黄芪汤的次级代谢物）是黄芪汤中的原药成分通过机体代谢新产生的。另外，有166种体内的代谢物（内源性代谢产物）由于服用黄芪汤发生了显著变化。在此基础上，对这3组数据的相关性进行了系统分析。同时，黄芪汤成分被体内吸收和代谢后，能显著调节机体数十种内源性代谢物通路，也就是说黄芪汤中的成分在体内代谢过程的同时能对机体的代谢发生影响，即产生了药效作用。 br/ img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/e541d04f-280a-4c86-94d6-205fbbba75b9.jpg" title=" 2.jpg" style=" width: 600px height: 500px " width=" 600" vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 500" border=" 0" / /p p 　　这个工作首次在临床试验中验证了Poly-PK研究思路的有效性和技术可行性。我们将Poly-PK结果与常规的药物PK结果做了比较，用UPLC-TQMS（三重四级杆）定量检测的五种药物成分与Poly-PK中的相应结果完全一致，但是后者能够提供的信息远远超出前者，所检出的化合物种类和数量、观察到的药物互相作用关系，以及获得的人体代谢应答信息（药效信息）是基于单一化合物的传统PK方法无可比拟的。 br/ /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/7a5ae499-214d-479f-a887-8ab245aa00c0.jpg" title=" 3.jpg" / /p p 　　Poly-PK也同样适用于复方化学药（西药）的研究。从Poly-PK概念的提出，到采用普洱茶在人群中开展验证性研究（proof of concept study），再到真正意义上的临床药代动力学研究，历时7年，因为觉得有意义，便一直摸索着做下来了。Poly-PK整合了药物分子轮廓分析和定量代谢组学技术，采用一系列多变量统计分析方法，可同时对数百种药物成分的体内代谢变化以及人体的代谢应答（药效）进行系统评价，研究展示了复杂的（黄芪汤中的）药物原型成分、经过代谢的次级成分、机体在（黄芪汤）药物影响下发生的代谢变化以及三者之间的相互关系，在系统水平上描绘出复杂药物系统的体内ADME全过程。 br/ br/ /p p strong 主要参考文献 /strong /p p 1. Lan K, Jia W. An integrated metabolomics and pharmacokinetics strategy for multi-component drugs evaluation. Current drug metabolism. 2010, 11(1):105-14. br/ /p p 2. Xie G, Zhao A, Zhao L, et al. Metabolic fate of tea polyphenols in humans. Journal of proteome research. 2012, 11(6):3449-57. br/ /p p 3. Lan K, Xie G, Jia W. Towards polypharmacokinetics: pharmacokinetics of multicomponent drugs and herbal medicines using a metabolomics approach. Evidence-based complementary and alternative medicine: eCAM. 2013 2013:819147. br/ /p p 4. Jia W, Fang T, Wang X, Xie G. The polypharmacokinetics of herbal medicine. Science, The Art and Science of Traditional Medicine. 2015, 350, 6262:871. https://www.sciencemag.org/custom-publishing/collections/art-and-science-traditional-medicine-part-3-global-impact-traditional br/ /p p 5. Xie G, Wang S, Zhang H, Zhao A, Liu J, Ma Y, Lan K, Ni Y, Liu C, Liu P, Chen T, and Jia W. Poly-Pharmacokinetic Study of a Multicomponent Herbal Medicine in Healthy Chinese Volunteers. Clinical Pharmacology & amp Therapeutics. 2017, Jul 4. doi: 10.1002/cpt.784. [Epub ahead of print]. /p

p 　　上 span style=" font-family: times new roman " 海市第六人民医院转化医学中心研究组最近应邀在美国《科学》杂志为中药研究增设的副刊Science,The Art and Science of Traditional Medicine上发表综述文章，贾伟教授针对中药研究的瓶颈问题——复杂成分中药的药代动力学，提出采用代谢组学与生物学分析技术相结合的手段进行多组分中药药物代谢动力学研究的新策略，并提出了Poly-PK(polypharmacokinetics)的新概念，文章以普洱茶中多组分的药代动力学为例子展示和总结了Poly-PK的研究思路和方法。 /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　普洱茶根据发酵工艺不同分为生茶和熟茶两种，生茶由晒青茶精制而成，熟茶则需经过渥堆、发酵的过程，并且一般认为普洱茶存放时间越长，茶的色泽味越好，生物活性作用也越强。前期的实验中，研究小组通过对存放1~ 10年的普洱熟茶成分谱的分析发现，随时间的增加，普洱茶的化学成分谱随之发生明显变化。与1年的普洱茶相比，10年的茶中的生物活性成分，如表儿茶素、葡萄糖含量增加，而茶中具有神经兴奋作用的咖啡因含量则相对减少。对不同工艺制备的茶进行比较后发现，茶叶中的色素，茶褐素(theabrownin, TB)在普洱茶中含量较高，而立顿红茶和龙井绿茶则以茶红素(thearubigin, TR)为主，这可能与普洱茶独有的渥堆发酵工艺有关。 /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　很多研究表明普洱茶具有降低血脂和血清总胆固醇水平的作用，但对普洱茶中究竟哪些是真正被机体吸收利用的活性成分并不十分清楚。研究小组利用代谢组学平台采用Poly-PK的研究思路对普洱茶中的化学成分进行了药代动力学研究。 /span /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: times new roman " img title=" mmexport1460432233165_副本.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201604/insimg/93710b3b-c992-413c-a4cd-62803605b87a.jpg" / /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　首先，研究人员对志愿者饮茶后0、1、3、6、9、12、24小时的尿液样本分别进行收集，然后采用超高效液相色谱四级杆-飞行时间质谱仪和气相色谱-飞行时间质谱仪对普洱茶提取液中所含化学成分以及人喝茶后尿液中的代谢成分的变化进行了研究。采用多元相似性分析方法，将喝茶后不同时间点的尿液与0点相比较，寻找到喝茶后引起改变的内源性物质118种。将喝茶后不同时间点的尿液与茶提取液相比较，得到尿液中有19种物质成分是从普洱茶中吸收的，还有26种物质成分是从普洱茶吸收并经体内代谢产生的，接下来又通过相关性分析研究表明这几组物质间存在正相关或负相关关系。如发现咖啡因与它的代谢产物次黄嘌呤、茶碱、马尿酸、3-羟基苯乙酸呈明显正相关。而次黄嘌呤与内源性小分子物质鸟氨酸、缬氨酸、酪氨酸等呈明显正相关，茶碱与2-甲基鸟苷呈正相关而与尿素等呈负相关，升高的3-羟基苯乙酸导致氨基丙二酸二乙酯和2-氨基丁酸的升高。该研究结果阐明了喝茶后能被机体吸收的成分物质以及能产生生物活性作用的物质组成基础，并以期刊封面论文发表在2012年的Journal of Proteome Research上。 /span /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: times new roman " img title=" mmexport1460432229668_副本.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201604/insimg/a1b5c4f9-1b44-4aa5-a2aa-44d092ff9430.jpg" / /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　Poly-PK的研究思路可以针对中药多组分的特点对复杂成分进入体内后的动态代谢过程，以及对机体内源性小分子代谢物的影响同时进行评价，阐明多组分药物在体内的吸收、代谢，清晰的了解复杂成分中药中哪些可能是具有生物活性的物质成分。 /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　原文出处: /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　1. Jia Wei, Fang Taiping,Wang Xiaoning, Xie Guoxiang. The polypharmacokinetics of herbal medicine.Science, The Are and Science of Traditional Medicine. 2015, 350, 6262:871. /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　2. Xie, Guoxiang Ye, Mao Wang, Yungang Ni, Yan Su, Mingming Huang, Hua Qiu, Mingfeng Zhao, Aihua Zheng, Xiaojiao Chen, Tianlu Jia, Wei*. Characterization of Pu-erh Tea UsingChemical and Metabolic Profiling Approaches. Journal of Agricultural and FoodChemistry. 2009, 57 (8): 3046–3054. /span /p p span style=" font-family: times new roman " 　　3. Xie Guoxiang, Zhao Aihua,Zhao Linjing, Chen Tianlu, Chen Huiyuan, Qi Xin, Zheng Xiaojiao, Ni Yan, ChengYu, Lan Ke, Yao Chun, Qiu Mingfeng, Wei Jia*. Metabolic Fate of Tea Polyphenolsin Humans. Journal of Proteome Research. 2012, 11(6):3449-54. /span /p p /p