雪莱遗传学通讯

表观遗传学：主要探索细胞内随时发生的化学变化如何影响基因的活动。这些化学变化有些可能是随机的，有些可能与生活方式或者饮食有关，而这种影响可能持续多代。 　　记者从华大基因研究院获悉，作为人类基因组学研究中最具潜力的项目之一，全球最大的表观遗传学研究项目将于9月6日正式启动。 　　该项目将对5000对双胞胎进行深入研究，来捕捉能够标记双胞胎间差异的细微表观遗传信号，寻找为什么同卵双胞胎不得同样疾病的答案，从而为开发疾病治疗药物提供核心靶点。 　　该项目的负责人表示，这种类型的研究过去仅在少数双胞胎中尝试过，此次的研究将把过去的研究放大1000倍。 　　将深入研究5000对双胞胎 　　该项目是世界最大的表观遗传学研究项目，由华大基因与伦敦国王学院的知名双胞胎研究团队TwinsUK共同发起，将对5000对双胞胎进行深入研究。根据预计，该项目将花费2000万英镑(约3000万美元)。 　　据华大基因研究院相关负责人介绍，表观遗传学是遗传学研究中最为前沿的领域之一，主要探索细胞内随时发生的化学变化如何影响基因的活动。这些化学变化有些可能是随机的，有些可能与生活方式或者饮食有关，而这种影响可能持续多代。 　　“表观遗传学研究是未来五年中我们发展的主要方向之一，此次我们的先进技术与独特的双胞胎样本资源的结合将会为全球学者提供一个前所未有的数据集。我们希望这个项目能够解开人类遗传学中一些仍旧未解的秘密，并且加速其在人类健康领域的研究和应用。”该项目联合负责人、华大基因执行总裁王俊教授表示。 　　由双胞胎表观差异找病因 　　这个项目计划在双胞胎中对2000万个位点的甲基化模式进行研究，并且在同卵双胞胎间进行比较。与以往研究不同的是，此次研究不是寻找相似之处，而是寻找那些能够解释为什么同卵双胞胎不得同样疾病的差异。 　　这个项目首先将以肥胖、糖尿病、过敏反应、心脏病、骨质疏松症和长寿等为主要研究对象，但研究方法可应用于各种常见性状和疾病。 　　“寻找双胞胎间那些至关重要的表观差异，将引导我们发现那些可以打开和关闭的关键性基因，从而进一步寻找致病原因，这些基因本身也非常可能成为药物治疗的关键靶点。”该项目联合负责人Tim Spector说。 　　“双胞胎本身就是极好的医学研究对象，加上我们用17年多的时间收集了双胞胎上百种疾病的详细资料和表型特征，使得这项研究非常独特。迄今为止这种类型的研究仅在少数双胞胎中尝试过，此次我们的研究将把过去的研究放大1000倍。”Tim Spector说。

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光可被细菌、藻类等低等生命和人类等高等动物通过视紫红质系统而感知。20世纪70年代后，几种细菌和藻类通道视紫红质的发现为光控系统的诞生奠定了基础。光遗传学最初由米森伯克于2002年首次实现并于2005年由迪塞罗斯（也译作代塞尔罗斯）和博伊登进一步完善，其应用极大地增强了对大脑功能的理解。 光遗传学可使科学家借助光来精确开闭特异神经元从而达到操纵神经元活性和动物行为的目的。光遗传学技术已被证明是在细胞和系统层面研究健康和病理大脑活性的一个非常强大且有用的工具。文章系统介绍了光遗传学诞生的历史背景、重大事件、发展过程、应用领域及重要价值等。 光对生命具有举足轻重的地位，“万物生长靠太阳”。对大部分植物而言，它们借助光合作用合成营养物质并释放出氧气，而动物则依靠这些营养物质和氧来维持生存。此外，光还可以指导细菌和植物的向光性，控制植物生长和开花时间。 对于人类和其他动物而言，借助光来观察和感知这个 “光明” 世界。该过程由 “眼睛” 完成，称为视觉。大部分视觉健康的人都可通过眼睛清晰地观察到这个世界，看到周围的花花草草和五光十色的世界。那么，我们是如何观察到这些事物的呢？文艺复兴后，人们对光的本质进行探索，从而对光的成像机制有了新认识，自然对视觉形成机制也产生浓厚兴趣。 视紫红质 视觉研究可追溯到18世纪。荷兰科学家列文虎克（Antonie Philips van Leeuwenhoek）借助显微镜观察眼视网膜结构，鉴定出视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）、视杆细胞和视锥细胞等，并推测这些细胞与视觉形成相关。1851年，德国解剖学和生理学家缪勒（Heinrich Müller，1820—1864）首次报道视网膜视杆细胞显红色这一现象 [1]。遗憾的是，缪勒错误地认为红色由血液造成。尽管如此，缪勒仍被看作视觉生理研究的先驱。缪勒在视觉生物学领域作出诸多贡献，如首次描述视网膜神经胶质细胞，这类细胞也因此获名“缪勒细胞”。 博尔（Franz Boll，1849—1879）是一位德国生理学家，对视觉形成具有浓厚兴趣。1876年11月，博尔也观察到红色视杆细胞，并认定红色源于其含有一类特殊物质，纠正了缪勒早期的错误。博尔还发现视杆细胞的红色受光影响，光照可导致红色褪去，而在暗处又重新恢复，进一步说明红色物质与视觉形成相关。遗憾的是，博尔的早逝（年仅30岁）使研究没有进一步开展。 1877年1月，博尔的同胞、另一位德国著名生理学家屈内（Wilhelm Friedrich Kühne，1837—1900）进一步纠正博尔的不足，认定视网膜感光物质应为紫红色，并创造 “视紫红质（rhodopsin）” 一词。屈内还取得另一项重大发现，即胆酸可使视杆细胞内的视紫红质释放到溶液里，并基于这一原理首次从牛视网膜完成视紫红质的纯化 [2]，屈内也因此成为视觉生理领域的奠基人之一（图1）。虽然已确定视紫红质参与视觉形成，但具体分子机制仍不清晰，直到20世纪30年代才有突破。图1 视紫红质的发现 视黄醛循环 1931 年， 美国眼科专家尤德金（Arthur Yudkin，1892—1957）开始对视网膜成分进行分析，发现其含有一种维生素A样物质。其实，人们很早就知道维生素A缺乏可影响视觉形成，最常见的一种疾病叫夜盲症，但对维生素A如何参与视觉却知之甚少。 1932 年， 美国生理学家瓦尔德（George Wald， 1906—1997）来到德国瓦伯格（Otto Heinrich Warburg，1931年诺贝尔生理学或医学奖获得者）实验室开始全面研究视紫红质。瓦尔德首先借助光谱分析法证明青蛙、绵羊、牛等完整视网膜中存在维生素A，接着使用氯仿提纯视紫红质，化学显色反应表明所含物质与维生素A非常相似。 为进一步证实结论，瓦尔德加入瑞士著名科学家卡雷尔（Paul Karrer，1937年诺贝尔化学奖获得者）的实验室，而卡雷尔分离并确定了维生素A的结构。经过3个月研究，瓦尔德最终确定视紫红质中确实含有维生素A，从而表明视紫红质包含两部分：视蛋白（opsin）和维生素A [3]。随后，瓦尔德又加入德国海德堡迈耶霍夫（Otto Fritz Meyerhof，1922年诺贝尔生理学或医学奖获得者）实验室继续开展视觉形成研究。 一次偶然事件为研究带来重大契机！当时正逢假期，许多实验室人员都去度假，恰在此时运抵300只青蛙。实验室助理原本想丢弃，而瓦尔德则主动要求留下来用作实验材料。瓦尔德从青蛙视网膜提取到足够量的视紫红质，进一步分析后惊奇地发现所含的维生素A与卡雷尔所得维生素A尽管大部分性质相似，但仍有些许差异，因此将这种物质重新命名为视网膜色素（retinene）。瓦尔德还发现视网膜色素与维生素A之间可发生转变，并通过后来详细的结构分析确定了两者间的差异，因此视网膜色素更名为视黄醛，而维生素A则称为视黄醇 [4]。 20世纪50年代，瓦尔德和同事经过近20年探索，最终解析出视觉形成的 “视黄醛循环” 机制：静息状态下，视杆细胞内视蛋白与11-顺视黄醛结合形成视紫红质；光线照射可使11-顺视黄醛发生异构化转变为全反式视黄醛，从而与视蛋白分离，这个过程激活视蛋白，启动下游信号转导最终到达大脑视觉中心；全反式视黄醛可被运输到视网膜色素上皮细胞内经过几步化学反应重新生成11-顺视黄醛；11-顺视黄醛回到视杆细胞再次与视蛋白结合形成视紫红质，从而完成一次视觉感知过程（图2）。瓦尔德的发现很好地诠释了视黄醛参与视觉形成的机制，因此他分享了1967年诺贝尔生理学或医学奖。图2 瓦尔德与视黄醛循环 后续研究还揭示了视蛋白作用机制。视蛋白是一种G-蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCR）。光通过改变视黄醛结构而激活视蛋白后，可进一步使异三聚体G蛋白激活，从而使磷酸二脂酶活化，催化cGMP水解为5’-GMP而减少cGMP含量；细胞内受cGMP调控的离子通道关闭，导致细胞膜电位出现变化，最终传导至视觉中心而实现光的感知。 从这个过程可以看出，哺乳动物视紫红质的作用机制较为复杂，作为机体视觉感知过程尚可接受，如果将它们应用到其他系统则困难重重，因此有必要寻找更简单的感光系统 [5]。 细菌感光 最初认为只有高等动物才存在视觉系统，但这一观念在20世纪60年代发生改变。1967年，德裔美国生理学家斯托克尼乌斯（Walther Stoeckenius，1921—2013）成为加州大学旧金山分校的教授，重点研究生物膜（如红细胞膜和线粒体膜）结构 [5]。由于生物膜材料获取比较困难，具有电子显微镜背景的斯托克尼乌斯决定用生物化学方法研究盐生盐杆菌（Halobacterium halobium）细胞膜组成。随后两位新同事的到来壮大了实验室的力量。 厄斯特黑尔特（Dieter Oesterhelt，也译作奥斯特黑尔特）是一位训练有素的德国化学家，跟随吕南（Feodor Lynen，1964年诺贝尔生理学或医学奖获得者）获得博士学位，由于学术休假的缘故来到美国；布劳罗克（Allen Blaurock）是一位刚毕业的英国生物物理学家，原来在国王学院威尔金斯（Maurice Wilkin，1962年诺贝尔生理学或医学奖获得者）实验室从事X射线衍射研究 [6]。 厄斯特黑尔特和布劳罗克借助X射线衍射技术观测细菌细胞膜紫色组分时，意外观察到一种清晰的衍射图像，说明其含有一种高度有序的生物分子。厄斯特黑尔特还观察到紫色物质在添加有机溶剂后颜色变黄。此时，布劳罗克回忆起在国王学院研究青蛙视网膜过程中也观察到类似的颜色变化，这一提示促使厄斯特黑尔特大胆假设该物质可能也是视紫红质。为证实这一假说，首先需解答的问题是其含不含视黄醛。 从细菌中寻找视黄醛这一近乎疯狂的想法促使厄斯特黑尔特立即启动验证工作。借鉴青蛙视紫红质的研究方法，厄斯特黑尔特发现细菌的紫色物质具有类似的物理和化学性质，并且还含有视黄醛。基于这些特性，厄斯特黑尔特和斯托克尼乌斯于1971年确定这是一种新型视紫红质，根据来源将其命名为细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR）（图3）[7]。图3 细菌视紫红质 斯托克尼乌斯经过进一步研究后发现，细菌视紫红质是一种光依赖的离子通道。更大的突破在1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的亨德森（Richard Henderson，2017年诺贝尔化学奖获得者）解析了细菌视紫红质的三维结构，从而对视紫红质的作用有了更深入的认识。 1972年，重组DNA技术的发明为生命科学带来一场革命，同时也积极推动了细菌视紫红质研究的发展。研究人员将细菌视紫红质转入宿主细胞，结果发现光照可引起氢离子外流，从而证明其为一种光控的氢离子通道。1977年，研究人员在细菌中又发现另一种视紫红质——卤视紫红质（halorhodopsin），后续证明其介导氯离子细胞内流 [8]。 一系列的研究表明，即使简单如细菌这样的单细胞生物也存在 “视觉系统”，标志着一个新领域——低等生物视紫红质的诞生，从而促使科学家去寻找其他视紫红质。 藻类趋光 班贝格（Ernst Bamberg）是一位德国生物物理学家，从20世纪70年代开始研究细菌视紫红质的生物学功能，并利用体外实验证实BR是一种光激活氢离子通道。随着基因工程技术的发展和完善，生命科学的研究模式发生根本性改变，膜蛋白研究不再需要繁琐困难的提取过程，只需将外源基因在特定宿主细胞表达即可。 90年代，已加入德国法兰克福马普研究所的班贝格与从美国回来不久的德国电生理学家纳格尔（Georg Nagel）决定合作，共同研究细菌视紫红质在完整细胞中的生物功能。1995年，他们合作将细菌视紫红质基因成功转入非洲爪蟾卵母细胞，进一步精确证实光激活质子泵的电压依赖性 [9]。2001年，他们进一步在非洲爪蟾卵母细胞中证实卤视紫红质是一种氯离子通道（图4）。班贝格与纳格尔的合作一方面建立了视紫红质功能研究平台，另一方面也初显光遗传学雏形，即将外源视紫红质在靶细胞表达。图4 藻类视紫红质 19世纪，绿藻（Chlamydomonas）等藻类就被发现具有向光性和受光调控的特性，但对这些现象背后的原因知之甚少。直到20世纪80年代，大量事实表明藻类也长 “眼睛”，即细胞膜存在感光物质，称为 “光受体”。 80年代初，德国生物物理学家赫格曼（Peter Hegemann）在博士就读期间就决定研究光受体。赫格曼和学生以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为材料，借助电生理实验表明光的确可诱导藻类细胞产生电流 [10]。赫格曼决定采用生物化学方法将光受体蛋白纯化后研究其性质。遗憾的是，十余年辛苦努力最终以失败告终。根本原因在于光受体是一种膜蛋白，含量低、稳定性差且异质性高，这些都是蛋白质纯化的大忌。赫格曼不得不转换研究思路来解决这个难题。 2001年，绿藻基因组测序的完成为问题的解决带来转机。赫格曼通过全面搜索和比对绿藻基因组数据库，从中发现两个候选基因与细菌视紫红质具有较高同源性。 为加快研究进程，赫格曼决定寻求合作。他在获悉纳格尔的研究工作后，积极沟通并与其达成合作协议。赫格曼小组负责克隆两种绿藻视紫红质候选基因，并将其送给纳格尔开展功能研究；纳格尔则将基因转入人肾胚细胞HEK293并实现正确表达。功能研究表明，它们的活性均受光调控，并且介导阳离子如钠离子、钙离子等的摄入（图4），因此将其分别命名为通道视紫红质（channelrhodpsin，ChR）1和2 [11-12]。与ChR1相比，ChR2光激活时间更短，且离子通透性更强，因此更适合于研究。更为重要的是，赫格曼还推测这些通道视紫红质不仅可在普通细胞表达，而且也可在神经元中表达并影响电生理活性。这一论断直接催生了光遗传学。 至此，研究人员已经鉴定出三类光控视紫红质，分别是细菌视紫红质（介导氢离子输出）、通道视紫红质（介导阳离子输入）和卤视紫红质（介导氯离子输入）。它们在神经功能研究方面具有何种应用价值呢？这要从神经兴奋说起。 神经兴奋 大脑是神经系统的中枢，是机体最复杂和最神秘的器官。知觉、运动、兴奋、情感、语言、学习和记忆等过程基本都在大脑特异区域完成。大脑由上百亿神经元（亦称神经细胞）构成，这些神经元之间通过特定方式实现彼此间交流，以达到协调控制机体各种行为的目的。神经元活性受电信号影响。 正常情况下，神经元细胞膜内外两侧阴阳离子分布不均匀（这种现象称为极性）：膜内钾离子浓度远高于膜外，膜外钠离子浓度又远高于膜内，最终形成一个外正内负的状态。未受刺激时（静息状态），规定膜外电位为0，则哺乳动物神经元膜内电位为负值，约-70mV，称为静息电位；外界刺激可导致离子通道打开，由于离子移动而引起膜两侧离子浓度发生变化，电位差也随之改变。如果-70mV向0方向改变，则称去极化（电位为0意味着内外无离子浓度差距，极化消失）；相反，-70mV向更大负值变化则称超极化（意味着离子分布不均匀加剧）。 一般而言，去极化伴随神经元激活，而超极化则意味着神经元抑制，因此通过改变神经元细胞膜内外离子分布可实现精准控制神经元活性的目的。 1979年，美国索尔克研究所著名科学家、DNA双螺旋提出者之一克里克（Francis Crick，1962年诺贝尔生理学或医学奖获得者）在《科学美国人》发表一篇文章 [13]，对脑科学未来的发展进行展望。古典神经生物学家通常采用电极刺激大脑特定区域神经元的方式来影响行为，克里克认为这种方法破坏性大且精确性不高，比如无法准确区分不同的神经元，这些因素导致所得结果准确性差。 为此，克里克提出应开发一种精确控制神经元活性的方法，允许研究根据需要只对特定神经元打开或关闭，同时不影响非相关神经元。具有分子生物学背景的克里克进一步指出可以对神经元细胞进行遗传改造，从而使它们可对外界信号（如光刺激）产生精准性应答。这一理念建立了光遗传学的思想雏形。 尽管光控细胞行为的理念已经提出，但真正实现则需要有可行的工具。2002年，这一想法终于首次变为现实。 神经光控 米森伯克（Gero Andreas Miesenböck）是一位奥地利神经科学家，跟随鲁斯曼（James Edward Rothman，2013年诺贝尔生理学或医学奖获得者）开展博士后研究。他主要借助荧光系统来检测神经元内囊泡运输，因而对光产生浓厚兴趣。 1999年，米森伯克建立自己的实验室，开始独立的科研生涯，目光锁定神经生物学。米森伯克对整个神经生物学领域一知半解，可以说有点 “门外汉” 的味道，但是恰恰这个因素反而使他在光遗传学方面首先完成突破，因为他不会受主流观点所羁绊。生命科学研究的基本策略在于首先控制某种因素（干预），然后依据结果确定因果关系，如敲除特定基因后动物出现某种表型异常（如个子变矮），据此可认为该基因参与了某个过程（如肢体发育）。 然而，由于神经系统自身的复杂性，长期以来神经生物学家主要依赖形态观察，而缺乏更多有效的干预手段。米森伯克想改变这一现状，他完全从一个生物学家的视点来看待这个问题，因此想为神经元安装一套感光系统（遗传学操作），然后借助光照（光学）来达到控制神经元的目的 [14]。为尽快实现这一目标，米森伯克邀请鲁斯曼的另一位学生、自己的师弟泽梅尔曼（Boris Valery Zemelman）加入团队，启动光控神经元活性的研究计划（图5）。