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课题研究的开始阶段,必须获得非典病毒基因。香港大学微生物系袁国勇教授是国际上较早分离出非典病毒并完成其基因分析的专家,车小燕曾与他进行过多年的合作,第一军医大学也早与香港大学建立了合作关系。于是,车小燕与袁国勇教授联系并达成合作研究协议,港大无偿提供非典病毒基因,使科研一开始就处于高起点的领先地位,为快速诊断试剂盒早日上市赢得了时间。 六、七月的广州正值盛夏,天气异常炎热,大家穿着厚厚的防护服,戴着面具和口罩,在实验室一呆就是十多个小时,出来时人都快虚脱了。课题组成员郝卫回忆,为最快拿出成果,他们与时间赛跑,一进实验室就像高速运转的机器,许多仪器因超负荷运转频发故障,但大家咬牙坚持,每天工作多达十八九个小时。饿了就吃碗方便面,实在顶不住了就趴在桌子上打个盹。 车小燕工作起来像上足发条的时钟,不知疲倦。她的丈夫工作也很忙,孩子面临中考,无人照顾,只好常吃方便面,以致现在“一见方便面就想吐”。负责制备针对非典病毒抗体的丘立文,在实验室连续工作一个半月,甚至有三四天没合过眼。技师廖志勇的父亲病危,家里多次来电报,但他没向任何人提起,仍全身心地投入工作,直到父亲病故的消息传来,他才请几天假回去料理后事。未能见上父亲最后一面成了他一辈子的遗憾。 去年9月,终于拿出了“SARS冠状病毒抗原诊断试剂盒”、“SARS冠状病毒酶促增敏化学发光免疫分析试剂盒”。但拿到中国生物制品检定所检定时,竟然对一些非典病毒敏感性较低。“难道我们选择的实验材料有问题?” 课题组决定对每一株非典病毒抗体都重新检测一遍。这意味着检测方法要推倒重来,又需一个半月时间。大家毫无怨言,毫不气馁,夜以继日,把制备的病毒抗体重新配对组合,用几十种配对方式对非典病毒广东株、香港株、北京株、美国毒株等10多种毒株进行敏感性检测。不到10天,一套新的试剂盒构建方案形成了。经复核对世界各地分离出的不同非典病毒毒株均能实现敏感检测,新的快速诊断方法符合国家质量标准。 兄弟单位无私提供非典样本,让试剂盒通过了对1000多份样本的临床考核,从而获准上市 试剂盒研制出来了,但更大的难题还在后面,必须通过非典样本的临床考核。这看上去简单,操作起来很难,因为非典样本少。比如,广东总共才有1000多例病人,不是每个病人都留下血清样本,再扣除污染因素,满打满算样本也就1000来份。而关于非典科研项目又多,有限的样本根本不能满足需要。另外,为防止非典样本发生泄露,国家又进行严格控制,所以要获得大量样本来考核试剂盒是否合格,非常难。 这时,省卫生厅伸出援手,由省疾病预防控制中心提供试验样本。总后卫生部部长作出批示,军事医学科学院也提供了200多份样本。这样,费了九牛二虎之力,终于弄到600多份样本。 今年4月1日,试剂盒拿到国家药审中心审评。尽管严谨的药审专家对检测结果感到欢欣,但还是认为临床考核病例数不够,需要补充临床资料。 还要弄样本?大家几乎被“逼”上绝境。就在这一关键时刻,学校和医院领导将情况向省科技厅作了专题汇报。省委常委、常务副省长钟阳胜,副省长雷于蓝高度重视,亲自协调,广州市疾病预防控制中心及时提供了300多份标本。 “借”样本虽然难,但也成为大家苦中有乐的回忆。在北京做实验时,大家吃住都在学校驻京办事处的小院里。为保证大家有充沛的体力,带队的黄震副院长亲自到超市采购、下厨,煲鸡汤、卤牛肉,给大家改善伙食。在科研碰到难题、压力时,院长、政委靠前指挥,解决问题。 兄弟单位无私提供的1000多份样本,让课题组如获至宝,加班加点进行检测,获得了1000余例临床考核资料,证明从病人发病的第一天到第10天均可在其血液中检出非典病毒,检出率达到了90%以上,准确率高达99%.今年4月,北京新发现几例非典疑似病例,国家疾病预防控制中心紧急调用珠江医院刚研制出来的试剂盒进行检测,检测结果与确诊意见完全一致。 中国工程院院士钟南山等专家建议将该诊断方法纳入国家非典诊断方案,便于早期发现和排查非典病人,及时阻断非典的传播。 为加快试剂盒的审批,使研究成果尽快推向市场,应用于临床,省和国家药监局开通“绿色通道”,第一时间审核申报资料。全国防治非典攻关领导小组亲临现场对项目进行考察论证,为试剂盒早日批准上市创造了条件。
以下转自http://gi.cmt.com.cn/detail/253665.html基于核酸适配子毛细管电泳分析技术的肝癌诊断新方法 目的 在前期工作中我们筛选出一批针对肝癌血清特异的核酸适配子。毛细管电泳是一种微量分析技术。本研究旨在建立一种基于毛细管电泳技术的核酸适配子与血清结合程度的分析方法,为适配子在肝癌诊断中的应用提供一种简便有效的新方法。 方法 人工合成5’端FAM标记的核酸适配子;将等差梯度浓度的适配子溶液进行毛细管电泳,以确定适配子的合适用量;将合适用量的适配子与等差梯度体积的肝癌混合血清孵育后进行毛细管电泳,以确定血清标本的合适用量;以适配子的合适用量为中心,将梯度浓度的适配子分别与合适用量的肝癌混合血清和正常混合血清孵育及检测,确定最佳的适配子用量;重复性试验分析毛细管电泳检测适配子与血清结合程度的精确性;以最佳的适配子用量与血清用量为条件进行临床标本检测,评价其对肝癌的诊断价值。 结果 本研究以适配子AP-HCS-9-90为模型,确定的最佳适配子用量为0.9pmol,合适的血清标本用量为1ml,毛细管电泳检测适配子与血清结合程度的重复性良好。以上述优化条件检测了41例肝癌血清标本和34例正常血清标本。适配子与血清孵育后毛细管电泳可显示A、B、C三个峰。肝癌血清标本的A、B、C峰面积分别为77949±158035、1328940±1882435、49909±9481,正常血清标本的A、B、C峰面积分别为15273±21043、377308±680039、50178±6868,两组间以B峰面积差异具有极显著性意义(t=3.009, P=0.004),A峰面差异有显著性意义(t=2.513, P=0.016),C峰面积差异无统计学意义(t=0.138, P=0.891)。B峰的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.869,诊断肝癌的敏感度为82.9%,特异度为79.4%,准确度分别为81.3%。多因素Logistic回归分析建立诊断模型,诊断价值可进一步提高,AUC为0.885,诊断肝癌的敏感度为90.2%,特异度为82.4%,准确度为86.7%。 结论 成功创建起基于毛细管电泳技术的核酸适配子与血清结合程度的检测方法,并在基于核酸适配子的肝癌诊断中具有良好的价值。