【飞诺美色谱】RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游离/非结合核苷
这种方法可以检测和定量合成类mRNA中大多数修饰的核苷。这不仅包括在体外转录过程中有意通过三磷酸盐引入的修饰,还包括商业化NTP原料变化引入的杂质,核苷被氧化产生的杂质等。该方法还能检测从帽结构释放的m7G或核糖甲基化修饰。使用LC-MS/MS,可以在核苷水平上分析mRNA,从而在单次运行中检测和量化数十种不同的修饰核苷。该方法可以很容易地对体外转录的NTP进行质量控制。溶液A:5mM醋酸铵缓冲液。乙酸调pH到5.3溶液B:乙腈。必须使用LC-MS级梯度条件:见下表样品制备用0.6U的核酸酶P1、0.2U的蛇毒磷酸二酯酶、0.2U的牛肠磷酸酶和10U的Benzonase核酸酶,在5mM Tris (pH8)和1mM氯化镁溶液中,37℃酶解2小时,将10μg的RNA酶切至核苷水平。另外,可以选择性地添加脱氨酶抑制剂,如喷司他汀(腺苷脱氨酶抑制剂,200ng)和四氢尿苷(胞苷脱氨酶抑制剂,500ng),以避免核苷降解。标样:腺苷或另一种主要核苷(C, U或G)色谱系统色谱柱:Synergi Fusion, 4μm, 80&angst 孔径, 250×2.0mm Phenomenex柱温:35℃流速:0.35mL/min检测器:UV 254nm仪器参数质谱仪:配备电喷雾离子源(ESI)的三重四极杆(QQQ)模式:正离子模式,dMRM(动态多反应监测)ESI参数:气体温度300℃,气体流量7L/min,雾化器压力60psi,鞘气温度400°C,鞘气流量12L/min,毛细管电压3000v,喷嘴电压0vQQQ参数:取决于必须检测的修饰核苷。建议对每台质谱仪的仪器参数(破碎器、碰撞能量、加速器电压)进行优化,以达到最佳灵敏度分析——相对定量用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。修饰核苷的量用腺苷校正,以消除进样量不同带来的差异。为此,从254nm处记录的紫外色谱中获取腺苷的峰面积。通过在每个样品中加入同位素标记的标准物进行定量。A(MS mod)=修饰核苷酸的MS峰面积n(ISTD)=每个样品的内标量A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积A(UV腺苷)=腺苷的峰面积或者,可以选择另一种主核苷(C、U或G)进行校正。例如,在酶促多聚腺苷酸化的情况下,它会导致未知或不同数量的腺苷。分析——绝对定量用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。修饰核苷的量用腺苷校正,以消除进样量不同带来的差异。为此,从254nm处记录的紫外色谱中提取腺苷的峰面积。使用外部校准溶液进行绝对定量。准备浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100和500nM的校准溶液,用于MS/MS检测修正,每个修饰含有等量的内标。每种稀释液注入10μL,在1-5000fmol范围内进行校准。对于腺苷,准备浓度为0.1、1、10和100fmol的校准溶液。每种稀释液注入5μL,在0.5-500pmol范围内进行校准。响应因子对应于校准曲线线性拟合的斜率(峰面积对应于各自的量)。X(每个修主核苷的修饰量)=绝对定量,每个主核苷修饰量A(MS mod)=各自修饰的MS峰面积A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积n(ISTD)=每个样品的内标量rf(MS mod/MS ISTD)=各自修饰物与内标物之比的响应因子A(UV腺苷)=腺苷的紫外峰面积RF(UV腺苷)=相应修饰的响应因子对于已定义的已知序列的mRNA:修饰核苷的数量可以归一化为RNA分子的数量。X(mod/RNA)=绝对定量,每个RNA分子的修饰量N(腺苷)=RNA序列中各自修饰的数目或者,可以选择另一种主核苷(C、U或G)进行归一化。防止在酶促聚腺苷酸化的情况下,导致未知数量的腺苷。参考文献:USP:Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality (Draft guidelines: 2nd Edition)