荭草素

二极管阵列检测器——从现象到本质看木犀草素沈国滨 施磊 金燕 01紫外检测器的进阶版本——二极管阵列检测器(Diode Array Detector, DAD)紫外检测器(Ultraviolet Detector, UV)是目前HPLC应用最广泛的检测器，其工作原理是朗伯-比尔定律。紫外检测要求被检测样品组分具有紫外吸收，通常选择在被分析物有最大吸收的波长处进行检测，以获得最大灵敏度和抗干扰能力。可惜这会导致其它组分在该通道下的吸收变弱甚至无紫外吸收。因此，单通道紫外检测器在对目标化合物，特别是未知化合物进行纯度及定量分析时，结果可能会产生严重的偏差。图1 朗伯-比尔定律（A=lg(1/T)=Klc） 二极管阵列检测器(Diode Array Detector, DAD)是一种新型的光吸收检测器，它采用光电二极管阵列作为检测元件，形成多通道并行工作，可对光栅分离的所有波长的光信号进行检测，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。可得任意波长的色谱图及任意时间的光谱图，具有色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，为定性、定量分析提供更丰富的信息。图2 二极管阵列检测器 02 DAD在天然产物构型变化监测时的妙用独一味（学名：Lamiophlomis rotata）是唇形科独一味属植物，有活血祛瘀，消肿止痛的功效，是青藏高原特有的一种重要药用植物。木犀草素是独一味叶中的主要成分 (Luteolin, CAS No. 491-70-3 )，是一种天然弱酸性的黄酮类化合物。木犀草素具有抗炎、抗过敏等作用，可用于治疗COPD、支气管哮喘以及慢性咽炎、变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。图3 木犀草素结构式本文基于赛默飞液相色谱系统和二极管阵列检测器，开发了一种可用于检测中药独一味胶囊提取液中木犀草素含量的方法。通过DAD检测器不仅可以实现定量分析，也可以用于色谱峰的定性分析。同时利用DAD全波长扫描的结果以证实木犀草素在流动相pH变化时会发生最大吸收波长红移，从而影响其在C18色谱中的保留等现象进行解释。 03 实验部分色谱条件流动相pH值对色谱行为的影响图4 流动相不同pH对于保留时间和吸收波长的影响 实验结合文献表明木犀草素对于流动相的pH敏感，依据计算模拟表明木犀草素的pKa 为 6.5±0.4。即在中性时，部分木犀草素可能以极性较强的离子形式存在，保留较弱；当调节pH为酸性时，抑制了电离，使得该分子以分子形式存在。借助二极管阵列检测器（DAD），可以实现全波长扫描，可以获得更全面的紫外光谱信息。木犀草素的紫外吸收波谱也对流动相的pH敏感，不仅保留时间产生了较大的差异，且随着碱性增强，最大吸收波长产生红移。表明该物质会在不同pH条件下产生不同的构象，且构象的变化会引起共轭结构的变化。 样品分析结果图5 标准品与样品对照色谱图（蓝色：标准品，黑色：样品） 图6 样品DAD三维色谱图（插图：8.640分钟的紫外吸收光谱图） 木犀草素保留良好，色谱峰形对称，无杂质干扰，可用于定性和定量分析。在0.3~100 μM 的范围内线性良好，相关系数R2达0.9999。进样精密度良好，标准品和样品的保留时间RSD均小于为0.2 %，峰面积RSD均小于为0.9 %。根据分析标准品保留时间的紫外吸收光谱，可见样品中对应色谱峰的最大吸收波长与木犀草素一致，推断该物质为木犀草素。根据校正曲线计算可得独一味胶囊提取液中木犀草素的摩尔浓度为27.4 μM。通过在样品中加入已知浓度的标准品来判断方法的准确性，该方法的回收率在95.9~103.0%之间。 04 结论本文基于赛默飞液相系统和二极管阵列检测器，开发了一种可用于检测中药独一味胶囊提取液中木犀草素含量的方法。通过DAD检测器不仅可以实现定量分析，也可以用于色谱峰的定性分析。利用DAD全波长扫描结合其它有关计算，验证了木犀草素在不同pH条件下最大吸收波长产生了红移，从而影响其在C18色谱中的保留。本文报道的方法能为极性小分子检测方法的开发提供定性和定量分析实验基础，为阐明色谱柱中的保留机理提供了理论依据，凸出了全波长扫描DAD检测器在分析物质变化过程和监测反应过程时的优势。

楔子：今年7月,可口可乐、百事可乐公司在印度生产销售的部分软饮料被检出毒死蜱、林丹和七氯等杀虫剂成分。消息传到国内，国家质检总局对此高度重视，并于2006年8月3日组织了大连市产品质量监督检验所等三家食品检验中心，对可口可乐、百事可乐、娃哈哈、雪碧等59批次软饮料进行抽样检验。大连质检所食品检验中心接到任务后当日即启动快速反应机制，组织人员到市场进行抽样，食品检验人员连夜检验，第二天就做出检验结果：未发现含有印度媒体报道的农药成分，并及时将检验结果上报国家质检总局，从而切实保障了消费者的利益，也保护了饮料生产企业的合法权益。为此，国家质检总局通报表扬了大连质检所雷厉风行的工作作风。 这次突发食品安全事件的处理，不禁使我们想起去年在全国炒得沸沸扬扬的“苏丹红”事件。2005年2月，英国食品标准管理局宣布召回含有苏丹红（1号）的食品；2月23日，国家质检总局发出紧急通知，要求全国质检部门严查含有苏丹红（1号）的食品；3月中旬，由大连市质检所起草制定的《食品中苏丹红染料的检测方法——高效液相色谱法》被国家质检总局监督司采纳为国家监督抽查方法；3月29日，国家标准委批准该方法为国家标准并予以发布。关键时刻，又是大连市质检所为全国严查“苏丹红”立下了汗马功劳。 是什么原因使一个地方质检机构能如此迅速地对影响全国的食品安全突发事件做出快速反应呢？ 紧急行动挑灯夜战，一周内攻克重大难题 “今日事今日毕，每天完成1％任务”——笔者注意到，在大连市产品质量监督检验所四楼走廊的墙上，悬挂着一张印有如此字样的标语牌。对于该所食品检验中心潘炜高级检验师和她的同事们来说，休息日从来都是一件奢侈的事，而也正是基于这种务实、勤奋的工作作风，苏丹红检测难题一周之内被迅速攻克。 通过简单的几次“瓶瓶罐罐”的处理，将提取出的液体样品送入液相色谱仪中进行分离检测，数十分钟之后就可以让辣椒酱、辣椒粉中的苏丹红染料原形毕露。回忆起2005年2月底那几天挑灯夜战的经历，“主攻手”潘炜高工的语气出人意料地平静：“其实平时我们也都是这么忙过来的，我们中心参与此项攻关的同事不超过8人，对于他们来说，晚上加班已经习以为常。虽然中心领导不赞成员工加班加点，只要求大家高效率的工作。可是，面对林林总总的待检样品，尤其是在那样的非常时期，责任心驱使大家经常工作到晚上八、九点，公休日已经形同虚设。 苏丹红事件发生后，总局在2月23日即要求各地质检部门加强对含有苏丹红（一号）食品的检验监管，24日我们立刻组织力量对检测方法进行攻关，当时一共设计了3套试验方案，没想到第一种方案就获得了成功，3月初我们已经开始办班培训了！” 新检测方法领先欧盟，特殊吸附剂打开成功之门 笔者了解到，大连市产品质量监督检验所开发的食品中苏丹红检测方法，与国外先进检测方法原理相近，但却改进了样品前的处理过程，可谓“四两拨千斤”，取得了超出预期的良好检测结果。 潘炜高工介绍，欧盟目前采用的分析仪器是“液质联用分析仪”，每台价值200万元人民币左右，可以准确检出样品中的苏丹红。“但是，国内就是我们这样的大所也是2006年才引进此类设备。由于成本太高，时间又紧，根本不可能在短期内实现全国普及。更重要的是，欧盟方法对操作人员要求很高，要短期内组织这么多操作人员很困难。‘苏丹红事件’开始之初，我们只是在质检总局的指导下借鉴了欧盟方法的一些理念，用相对落后的设备进行检测。” 在最初的几天里，食品检测中心对大量送检的样品进行测试，潘炜和她的同事们惊奇地发现，样品如不采用先进仪器进行最后分析，很有可能出现误判。“在当时的检测曲线中有一个干扰项峰值，其实根本与苏丹红无关，但和苏丹红3号的图谱几乎完全吻合，迷惑了很多专家。这个干扰项用色谱仪器是无法甄别的！最初的几天，你可能看到全国媒体报道‘含苏丹红产品’数量不断增加，其实其中很多产品是被冤枉了。当时全国只有少数几个大的质监所意识到了这个问题，不少检测部门对一些产品却出现了误判。” 经过努力，潘炜和同事们发现了一种特殊的吸附剂，找到了“打开大门的钥匙”。现在，只要将样品（如辣椒酱）用有机溶剂进行固体、液体分离后，再使用新发现的吸附剂，就可以从样品中“吸”出纯净的苏丹红，结果十分完美。按照这种方法，全国大部分质监所拥有的液相色谱分析仪可以准确地完成检测任务，解决了短期内设备短缺问题。该方法在适用范围、检测成本、精确度等方面均优于欧盟方法，前处理技术达到国际领先水平。 未雨绸缪，再攀高峰 2006年6月1日，国家标准委正式批准辽宁省大连市质检所研制的采用离子色谱法测定小麦粉和小麦粉品质改良剂中溴酸盐检测方法为国家标准。该项国家标准是大连市质检所继研制苏丹红国家检测标准后又一项新的国家标准。 自上世纪80年代起，我国的面粉、面包生产企业中滥用添加剂的现象比较普遍，饺子粉、面包粉、高筋粉、拉面粉，甚至是未成熟的小麦粉、潮湿变质的小麦粉，都普遍使用溴酸盐来作为品质改良剂。目前世界卫生组织已确认溴酸根是一种氧化性致癌物，主要能导致动物的肾和膀胱组织发生癌变。一些发达国家近10年中先后颁布了禁用溴酸盐作为面粉改良剂的行政性指令，欧盟、澳大利亚、新西兰甚至一些中小国家及我国的台湾及香港地区也已禁用，美国、加拿大、日本等国已大幅度减少溴酸盐的使用量。但由于面食品中溴酸盐残留量的检测非常困难，长期以来国内外没有成型方法可循，美国公职化学家学会AOAC推出的官方分析法956.03规定了白面粉和全麦粉中溴酸盐和碘酸盐的测定法——亚硫酸盐滴定法，自1956年以来已被应用了近50年，该方法是一种常规化学分析法，采用亚硫酸盐还原性来测定溴酸盐的弱氧化性，方法经典，但应用繁杂，准确度差，检出不灵敏（最低定性检出限为1mg/kg，定量检出限为10mg/kg）。 当谈到这一当时可以称得上是具有前瞻性的工作时，作为标准的第一起草者，潘炜高工依然惜字如金，“我们所是在2004年开始关注这一问题的，当时所里组织我们进行溴酸盐检测方法的研究，2005年3月研究取得成功，并上报了国家标准委。” 也就是在此后不久，2005年6月，国家卫生部、国家质检总局、国家标准化管理委员会分别发出通知：自2005年7月1日起，在GB2760《食品添加剂使用卫生标准》中取消溴酸盐作为面粉处理剂使用。这样一来，大连市质检所的检测方法立刻引起了国家许多部门的重视，经过国内离子色谱界专家反复论证后认为，该方法使用成本低、各项技术指标优于国际权威的AOAC标准方法。最终方法经国家标准委批准为国家标准，并于2006年6月1日起正式实施。 加大“软硬件”投入，提升检验实力 近几年来，大连市产品质量监督检验所食品检测工作叫响全国，而所有这些成绩的取得均离不开质检所所领导的高瞻远瞩，全局谋划。从潘炜高工处，笔者了解到，2000年以来，大连市质检所在国家质检总局和大连市政府的支持下投资近千万元购买了液质联用仪、气质联用仪等一系列国际先进的食品检测仪器，实现了转基因食品、食品添加剂、食品微生物、农药残留、营养成分等500多个检验项目，保证了食品检测通道的准确、快捷。笔者在参观中心实验室时发现，安捷伦科技最新款的5975GC/MS、1200HPLC，以及WATERS公司大名鼎鼎的UPLC/MS/MS等，这些当今全球一流的分析检测设备在这里都可以看到它们的身影。 除了实验室硬件方面的巨大投入外，大连市质检所还大力开展了检验人员再培训工作，同时积极从外单位引进专业技术人才，以增强质检所的检验实力。潘炜高工本人就是大连质检所王春燕所长千方百计从新疆调来本所工作的。来所前，潘炜高工已从事药品、食品检验工作18年，具有丰富的一线实践经验。目前，食品中心已拥有高级工程师5人、工程师11人、硕士研究生6人。应当说，大连市质检所的设备和技术力量在国内堪称一流。而也正是该所多年的投入与积累，才能有今天的厚积薄发，才能在国家最需要的关键时刻，一显身手。 采访后记 近些年来，有关食品安全突发事件的报道屡屡见诸于国内报端，而我国现阶段食品安全问题的严重性究竟到了一个什么程度也是众说纷纭，彼此不一。2004年，本网也曾经专门就此话题采访过业内资深专家。这一次，我们则把关注的目光投向了当前正奋战在食品安全检测一线的广大质检人员。从潘炜高工和她的同事身上，笔者深刻感受到，作为普通百姓饮食安全的忠诚卫士，国内广大的食品安全检测人员没有辜负国家与人民交付的重托，“为国分忧、为民负责”已成为他们共同的信念。 单位地址：辽宁省大连市沙河口区万岁街68-2号（116021）

各有关单位及专家：由惠州市食品药品检验所提出，惠州市食品药品检验所、广东省惠州市质量技术监督标准与编码所等单位负责起草的《金莲花软胶囊中荭草苷和牡荆苷的含量测定 高效液相色谱法》、《药品微生物菌种管理技术规范》、《LC-MS/MS液质联用法测定凉茶中非法添加的22种化学药物》等3项团体标准已完成征求意见稿的编制，根据《惠州市标准化协会团体标准管理办法》的相关规定，为保证标准的科学性、严谨性和适用性，现公开征求意见。请各有关单位及专家对本标准提出宝贵建议和意见，于2024年3月5日前以邮件的形式将《征求意见表》反馈至指定邮箱。联系人：杜琦杰电话：0752-2780906邮箱：hz_bzhxh@163.com附件：1. 关于《金莲花软胶囊中荭草苷和牡荆苷的含量测定 高效液相色谱法》等3项团体标准公开征求意见的通知2. 《金莲花软胶囊中荭草苷和牡荆苷的含量测定 高效液相色谱法》（征求意见稿）3. 《药品微生物菌种管理技术规范》（征求意见稿）4. 《LC-MS/MS液质联用法测定凉茶中非法添加的22种化学药物》（征求意见稿）5. 征求意见表 惠州市标准化协会2024年2月2日惠州市标准化协会关于《金莲花软胶囊中荭草苷和牡荆苷的含量测定 高效液相色谱法》等3项团体标准公开征求意见的通知.pdf《金莲花软胶囊中荭草苷和牡荆苷的含量测定 高效液相色谱法》（征求意见稿）.pdf《药品微生物菌种管理技术规范》（征求意见稿）.pdf《LC-MSMS液质联用法测定凉茶中非法添加的22种化学药物》（征求意见稿）.pdf征求意见表.docx.doc