二苄肼

1.透射电镜（TEM）成像挑战透射电镜高分辨成像是新材料结构研究不可或缺的技术之一，尤其是发展得欣欣向荣的二维材料界， 得益于它们易于剥离或者生长成薄膜的性质， TEM在二维材料成像上可谓所向披靡。近年来二位聚合物是潜力无限的新兴二维材料，我们可以用乐高来想象二维聚合物，不同的积木结构（单体monomers）通过在水和气体界面聚合搭出一个二维的网格，每层网格之间再通过范德华力结合。各式单体带来了材料结构和性能的无限可能[1]，与此同时结构的解析是发展新二位聚合物过程中不可或缺的一环。在TEM的成像的过程中，高速电子如同密集的子弹穿透研究材料，和材料进行碰撞并传递能量，一方面电子携带了结构的信息，同时这种强力轰击又破坏了材料的结构，连锁反应导致大面积的积木的轰然倒塌。这意味着我们只能用非常少量的电子来获得结构信息，否则材料就会被打乱成无序状态。然而电子少信息也少，只能得到低清的图像，缺乏高清细节。因此TEM表征二维聚合物以及所有对电子轰击敏感的材料是电镜领域的一大挑战。图1，辐照损伤黑魔法（图1左作者 J. S. Pailly, 来源， 中右来源：depositphotos）2.优化电压，突破2 埃[2]！乌尔姆大学的Kaiser教授电镜组的研究人员梁宝坤和戚浩远博士接受了这个挑战。重要的第一步，就是研究如何降低电子对于材料的损伤。进而提高成像的分辨率，看到二维聚合物里前所未见的细节。在TEM中，电子发射的速度是影响着电子对材料杀伤力的重要条件之一。研究人员在高分辨成像使用的电压范围内 （80-300 kV）， 通过电子衍射量化测量了二维聚亚胺能收受的总最大电子轰击量。然而这里我们需要注意的是，由于电子和材料结构相比如此微小，不少电子在分子积木搭建的二维结构间隙中穿过，因此使用的电子总量高并不代表能获得更多结构信息，我们还需要得到其中递信息的电子的比例。在图表中，可以看到这两个变量相对电压有着相反的变化趋势。结合两个变量，我们得到电子利用的最高效率在120 kV 达到顶峰。图2 二维聚亚胺结构图示。材料可承受电子量，结构信息比例和电子利用效率不同电压的量化分析。最优电压和相差矫正的强强联手，研究人员终于看到了高清版的二维聚亚胺结构，成像分辨率首次达到了2 埃以内，细节历历在目！图3 2D-PI-BPDA 和2D-PI-DhTPA的高分辨图像以及图像模拟。FFT显示出图像分辨率突破 2 埃。3.首次呈现间隙缺陷表活引导的界面二维聚合物合成方法，实现了晶圆尺寸级别的高结晶度的薄膜自下而上的生长[3][4]。样品晶区之间的晶界结构以及晶体缺陷材料非常重要的特征。通过优化TEM成像条件，清晰的视野使更多结构细节得以浮现，二维聚亚胺的单体卟啉中心4埃直径的孔道清晰可见。然而在某些区域，图像上的‘异象‘让研究者一时以为自己眼花了。2D-PI-BPDA 的孔洞的四个角出现神秘亮点，2D-PI-DhTPA里发现的则是半月形的弧线。通过文献分析和密度泛函（DFTB）的计算的帮助，终于解密了这些神奇的图案来自于卟啉分子在规整的二位聚合物网格中形成的间隙缺陷。研究人员解释这种缺陷产生的动力来自于被酸性环境质子化之后带正电荷的分子间产生的静电排斥作用。就如同乐高积木上突然长出了一些新的凸起点，导致它们无法完美堆叠在一起。然而当他们扭转或者平移之后，对抗解除，就可以继续堆叠，从而构成了类似统计模型中展示的结构。图4 2D-PI-BPDA 和2D-PI-DhTPA的间隙缺陷图，DFTB计算结构以及图像模拟。4.分辨单体侧边官能团得益于分辨的提高，单体侧边的官能团能够被直接分辨。单体DhTPA 的苯环上2，5对位各链接了一个氢氧根，研究人员通过对比图像上单体宽度的半峰宽惊喜地发现在目前in-focus成像条件下，官能团的氢氧根侧链能被轻松分辨。这对理解二维聚合物的通道环境对材料性质的影响有重要意义。图5 2D-PI-BPDA 和2D-PI-DhTPA 链接单体的结构，以及其高分辨图像宽度测量。5.应用展望研究人员继续对半无序状态下的亚胺进行了成像和分析， 从图可见，原本六边形的网格结构被许多五边和七边的结构取代。为了量化分析，研究人员利用了神经网络的方法来分析结构中多边形的配比，以及单体间距的长短角度。这个新工具可以帮助电镜研究人员进一步提高数据分析的效率，跨学科联合，事半功倍。图6 a-PI 高分辨成像以及神经网络图片分析结果。参考文献:[1] Feng X and Schlüter A D 2018 Towards Macroscopic Crystalline 2D Polymers Angew. Chemie - Int. Ed.5713748–63[2] Liang B, Zhang Y, Leist C, Ou Z, Položij M, Wang Z, Mücke D, Dong R, Zheng Z, Heine T, Feng X, Kaiser U and Qi H 2022 Optimal acceleration voltage for near-atomic resolution imaging of layer-stacked 2D polymer thin films Submitted[3] Ou Z, Liang B, Liang Z, Tan F, Dong X, Gong L, Zhao P, Wang H, Zou Y, Xia Y, Chen X, Liu W, Qi H, Kaiser U and Zheng Z 2022 Oriented growth of thin films of covalent organic frameworks with large single-crystalline domains on the water surfac J. Am. Chem. Soc.[4] Sahabudeen H, Qi H, Glatz B A, Tranca D, Dong R, Hou Y, Zhang T, Kuttner C, Lehnert T, Seifert G, Kaiser U and Fery A 2016 Wafer-sized multifunctional polyimine-based two-dimensional conjugated polymers with high mechanical stiffness Hafeesudeen Nat. Commun.71–8

1873年，德国科学家阿贝（Abbe）根据衍射理论首次推导出衍射分辨极限，即能够被光学分辨的两点间的距离总是大于波长的一半。换句话说，传统的光学显微镜分辨率有一个物理极限：它不可能突破0.2微米，这也被称之为“阿贝魔咒”。而艾力克贝齐格（Eric Betzig）、斯特凡W赫尔（Stefan W. Hell）和WE莫尔纳尔（W. E. Moerner）于2014年被授予诺贝尔化学奖，正是因为突破了这个极限。由于他们的成就，光学显微镜现在可以进入纳米世界了。相较于另一种大家熟悉的超高分辨率成像技术——电子显微镜，超分辨率光学显微镜有其独特的优势，譬如通过它可以对单个活体细胞内部的结构和生理活动进行观察，而电子显微镜是无法做到这一点的。 这三位科学家可能没有想到的是，他们的获奖也极大促进了中国超分辨率显微镜市场的发展。 通过日前在中国科学技术大学生命科学学院召开的第八届中国生命科学公共平台管理与发展研讨会显微成像技术论坛，笔者近距离接触了许多来自中国顶级科研机构的生命科学实验平台显微成像部门的一线管理及技术人员，也近距离感知了超分辨率显微技术的热度。 尽管传统的激光扫描共聚焦显微镜依然是当前细胞生物医学成像领域的主力仪器，但得益于2014年诺贝尔化学奖的结果，中国相关领域的越来越多的研究人员已开始把目光投向了更加先进的超高分辨率光学显微镜。而徕卡、尼康、蔡司等主流光学显微镜厂商也及时把握商机，纷纷加大了相关产品在华的推广力度。据笔者了解，实际上在2014年之前，基于不同超分辨率原理的商业化产品在市场上已经可以看到，只是由于价格较为昂贵，没有引起大家太多的注意。到2014年，这一市场才开始真正发力，据保守估计，去年中国市场相关产品的销售数量至少在10台以上。本次会议上不少单位对该类产品也表现出了浓厚的兴趣，纷纷流露出购买意向。 与此同时，中国的一些科研单位（譬如：浙江大学，中科院苏州医工所等）也在进行超分辨率光学成像技术的研究工作。我们期待这项技术能够帮助纳米工程、生物工程、医学、材料学等相关研究领域的科学家获得更多的发现。（主编当班） 显微成像技术论坛来自科研机构的报告嘉宾分别是：浙江大学医学院 吴航军中科院上海生化细胞所细胞分析技术平台 王艳国家蛋白质科学中心（上海） 于洋南京医科大学分析测试中心 胡凡中国科学技术大学 吴旭

Edward Boyden 　　我们都知道，显微镜能够放大活细胞和组织，但是你想过用它观察更微小的细节么?这听起来特别像一个看过多次《爱丽丝梦游仙境》的科学家的幻想。但是，生物学家们以这个概念为基础发明来一种新的技术，利用普通的显微镜对整个大脑进行成像，展示出了精致的分子细节。 　　这项技术叫做expansion microscopy，使用一种通常在婴儿尿布中可以找到的材料使生物组织膨胀。剑桥麻省理工学院(MIT)的神经学工程师(neuroengineer)Edward Boyden在上个月举行的一场会议中与他MIT的同事Fei Chen 和 Paul Tillberg报告了该技术。 　　Expansion microscopy：超分辨率显微镜的转折 　　Expansion microscopy是超分辨率显微镜的一个转折。2014年，美国科学家埃里克&bull 白兹格(Eric Betzig)，德国科学家斯特凡&bull W&bull 赫尔(Stefan W. Hell)，美国科学家威廉姆&bull 艾斯科&bull 莫尔纳尔(William E. Moerner)因超分辨率荧光显微技术获得了诺贝尔化学奖。这两种技术都在试图绕过物理定律带来的限制。 　　1873年，德国物理学家Ernst Abbe推断，传统的光学显微镜不能区分距离小于200纳米的物体，这大约是可见光最短波长的一半。距离小于这个衍射极限的话，物体会变得模糊。光学显微镜的最大分辨率只能达到横向200纳米，纵向600纳米。 　　超高分辨显微镜通过使用荧光分子绑定蛋白，更好的定位分子的发光来源，从而克服了Abbe指出的限制。利用这种技术，科学家可以区别出距离近达20纳米的物体。不过这项技术需要昂贵的、专业的设备，但可以解决一些厚结构的研究难题，比如大脑或肿瘤。 　　神经科学家们一直想收集大脑更多的分子细节，比如神经突触中蛋白的位置、两个神经传递信息处的连接、甚至环绕大脑的一组神经元。 　　在NIH的会议中，Boyden说：&ldquo 我们一直想做的就是找出让物体变得更大的方法。&rdquo 为了实现这个目标，他的团队用了一种叫做acrylate的化合物，该物质含有两种特性：第一，它可以形成密集的网状结构将蛋白质固定住 第二，它在水存在的情况下会膨胀。 　　加点水，让一切变得神奇 　　首先，组织需要经过一组化学混合物处理，使它变得透明 然后，用荧光分子绑定特定蛋白 最后将acrylate注入组织中。就像婴儿尿布一样，加水会使acrylate聚合物膨胀。经过拉伸，荧光标记的分子之间的距离越来越远。之前因为太近无法区别的蛋白在光学显微镜中有了新的焦点。在Boyden的展示中，该技术可以解决膨胀前分子距离近达60纳米的难题。 　　最重要的一点是，膨胀的过程很大程度上维持了蛋白之间的相对方向和连接，保持其它细胞结构的完整。该技术使蛋白相对位置的失真程度为1-4%。Expansion microscopy与其它超高分辨技术相比表现了良好的性能。 　　在一项试验中，研究人员用Expansion microscopy测定膨胀的小鼠大脑神经突触两端的蛋白质之间的距离，结果与用超高分辨技术测量的数据几乎相同。 　　此外，Expansion microscopy在复杂组织的三维成像上表现的更好。在会议中，Boyden展示了一个半毫米厚度的小鼠大脑海马区的图像，揭示了邻近神经元之间的连接。放大图像还能看到突触结构的细节，叫做boutons，是释放神经递质的地方。Boyden的团队用Expansion microscopy还研究了果蝇和斑马鱼的大脑，目前正在用研究人类的大脑。 　　技术总是在不断的超越 　　加州理工学院的神经学家Viviana Gradinaru说，Boyden的这项技术是科学家如何通过改变生物组织绕过固有限制的好例子。2013年，Gradinaru与斯坦福大学的Karl Deisseroth领导的团队报告了一种去除脂肪，从而让小鼠完整大脑透明化的方法。这种方法让厚的组织在光学显微镜下得以成像。去年，Gradinaru的团队将这项技术运用到了其它器官和整只老鼠中。 　　悉尼大学显微镜专家Guy Cox说：&ldquo Expansion microscopy确实非常巧妙，但是它的实际用途有多大还不清楚。如果它要用在很关键的地方，我推测它会与超高分辨技术结合起来。它的着重点应该是分子研究，而不是整个细胞。&rdquo